Название работы	Кол-во страниц	Размер
Инструкция по применению «Микробиологическая диагностика заболеваний...	1	22.06kb.
Урок 11. Тема: Многообразие организмов. Бактерии. Элементы содержания...	1	48.68kb.
Методические указания к лабораторной работе по курсу «Теория волновых...	1	123.87kb.
Методические указания к лабораторной работе по курсу «Теория волновых...	1	109.46kb.
Методические указания к лабораторной работе по статистической радиофизике...	5	670.31kb.
Методические указания к лабораторной работе №14 Волгоград 2013 (076.	1	160.03kb.
Методические указания к лабораторной работе по курсу «Методы и средства...	1	242.39kb.
Инструкция по выполнению лабораторной работы по дисциплине "Химическое...	1	212.95kb.
Методические указания к лабораторной работе №1 по курсу " Основы...	1	166.16kb.
Практикум по экономике труда часть 1 Методические указания	4	703.96kb.
Методические указания к семинарским занятиям	1	236.28kb.
Обоснование различных схем очистки зерноочистительного агрегата,...	1	78.89kb.
Викторина для любознательных: «Занимательная биология»	1	9.92kb.

Приложение 3.

ИНСТРУКЦИЯ

ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ

СПЕЦИФИЧЕСКИХ ДНК-МАРКЕРОВ ЕSCHERICHIA COLI O104:H4

В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУРАХ И КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

1. 
   НАЗНАЧЕНИЕ
   

Набор предназначен для выявления специфических ДНК-маркеров Еscherichia coli серотипа O104:H4 в бактериальных культурах, клиническом материале и пищевых продуктах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.

2. 
   ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
   

Набор содержит компоненты, необходимые для проведения ПЦР, в результате которой происходит амплификация специфических фрагментов ДНК Еscherichia coli серотипа O104:H4 - генов stx2 (шига-токсина 2), rfb-O104, контролирующего синтез первичных боковых цепей ЛПС (определяет серогруппу O104), flicH4, определяющего синтез жгутикового антигена H4.

В качестве внутреннего контроля используется дополнительная пара праймеров на консервативную область гена 16S rRNA. Это позволяет учесть возможное ингибирование реакции и исключить ложно-отрицательный результат.

2.1 Принцип действия

В основе метода лежит полимеразная цепная реакция с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. Детекция продуктов амплификации осуществляется электрофорезом в агарозном геле.

2.2 Состав набора (на 100 реакций)

- ПЦР-буфер - 2 пробирки по1,2 мл

-Taq-POL (Taq I –полимераза) - 40 мкл

- смесь Мульти O104 - 500 мкл

- dNTP (смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов) - 50 мкл

- dH₂O (деионизованная вода) - 400 мкл

- мин. масло (минеральное масло) - 2,0 мл

- O104+ (положительный контроль) - 100 мкл

3 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ

• 
  ПЦР–бокс или отдельный стол, снабженный УФ-лампой
  
• 
  Твердотельный термостат или водяная баня
  
• 
  Набор автоматических пипеток переменного объема
  
• 
  Одноразовые наконечники для автоматических пипеток
  
• 
  Пробирки для микропроб объемом 1,5 мл
  
• 
  Пробирки для ПЦР на 0,5 мл или 0,2 мл
  
• 
  Вортекс-центрифуга
  
• 
  Центрифуга настольная
  
• 
  Термоциклер
  
• 
  Охладитель проб
  
• 
  Источник тока
  
• 
  Электрофорезная камера
  
• 
  Источник УФ
  
• 
  Весы лабораторные 2 класса точности
  
• 
  Холодильник бытовой с морозильной камерой
  
• 
  Отдельный халат и одноразовые перчатки
  
• 
  Емкость для сброса использованных наконечников
  
• 
  Вода дистиллированная
  

4. 
   ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
   

4.1. Приготовление образцов для анализа в ПЦР: бактериальные клетки суспендировать в 100 мкл стерильной дистиллированной воды до концентрации 10⁷ – 10⁹ кл/мл в пробирках 1,5 мл типа «Эппендорф». Пробы прогреть при температуре 98 ºС в течение 15 минут (твердотельный термостат или водяная баня). Центрифугировать 5 минут при 2000-3000 g (4000-6000 об/мин.). Для многократного использования хранить при температуре минус 20 ^оС.

Для приготовления образцов из клинического материала использовать коммерческие наборы для выделения ДНК из клинического материала, например, «ДНК-сорб-B», «ДНК-экспресс», следуя указаниям инструкции изготовителя.

4.2 Проведение ПЦР

1. Перед проведением ПЦР-анализа внести в одну или обе (в зависимости от объема исследования) пробирки «ПЦР-буфер» по 20 мкл фермента TaqI-полимеразы из пробирки «Taq-POL». Полученной смеси «ПЦР-буфер+» в каждой пробирке достаточно для проведения ПЦР-анализа 50 образцов. Смесь ПЦР-буфера с TaqI-полимеразой «ПЦР-буфер+» можно хранить при температуре +4 ºС не более 6 мес. Отдельные компоненты «ПЦР-буфер» и «Taq-POL» можно хранить при температуре минус 20 ºС в течение 1 года.

2. Перенести содержимое пробирки «dNTP» в пробирку «смесь Мульти O104» . Полученную смесь «Мульти O104 с dNTP», рассчитанную на 100 реакций, можно хранить при температуре + 4 ºС в течение 6 мес.

3. Включить охладитель проб (для охлаждения штативов с пробирками можно использовать ледяные блоки).

4. В охлажденный штатив расставить ряд пробирок для ПЦР. Количество пробирок должно соответствовать количеству анализируемых образцов с учетом двух дополнительных пробирок, предназначенных для отрицательного и положительного контролей.

5. Внести на дно каждой пробирки по 20 мкл смеси «ПЦР-буфер+» (ПЦР-буфер с Taq I –полимеразой, п.1).

6 Добавить во все пробирки по 5 мкл раствора «смесь Мульти O104 с dNTP» (п.2).

7. Добавить во все пробирки по одной капле (~20-30 мкл) минерального масла. Если используется термоциклер с подогреваемой крышкой, то минеральное масло не добавлять.

8. В пробирку для отрицательного контроля внести 5 мкл деионизованной воды - «dH₂O».

9. В пробирки для исследуемых образцов внести по 5 мкл лизатов клеток или 5 мкл образцов, выделенных из клинических проб.

10. В пробирку для положительного контроля внести 5 мкл раствора «O104+»

11.Все пробирки встряхнуть на вортексе, жидкость осадить на дно пробирок кратковременным откручиванием на вортекс-центрифуге. Пробирки поместить в блок термоциклера после прогрева прибора в режиме паузы при 95°С (режим горячего старта).

12. Провести реакцию амплификации по программе: 1-й цикл: 95 °С - 5 мин, 58 °С - 1 мин, 73 °С - 1 мин; далее 30-40 циклов: 94 °С – 30 сек, 60 °С – 30 сек, 72 °С – 30 сек; в конце: 1 цикл: 72 °С - 3 мин, 10 °С – охлаждение (хранение). При тестировании лизатов клеток достаточно 25-30 циклов реакции.

13. После окончания реакции амплификации пробирки отправить в комнату для анализа продуктов ПЦР. Пробы после амплификации можно хранить в течение нескольких дней при 4-8 °С и несколько месяцев при минус 20 °С.

4.3 Анализ продуктов ПЦР

4.3.1 Приготовление агарозных гелей для электрофореза

Трис-боратный буфер (ТБЕ) для электрофореза: готовится концентрированный (пятикратный) буфер 5×ТБЕ (54 г Трис-осн., 27 г борной кислоты, 20 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0 растворяется в 1 л дистиллированной воды), который разводится перед проведением анализа (к 200,0 мл 5×ТБЕ добавить 800,0 мл дистиллированной воды).

Буфер для нанесения образцов (десятикратный): 0,025 г бромфенолового синего; 4 мл глицерина; 5 мл 0,5 M ЭДТА, pH 8,0; довести до 10 мл дистиллированной водой.

Раствор 1,5 % агарозы: взвесить 1,5 г агарозы, растворить в 100 мл ТБЕ буфера, поставить в кипящую водяную баню и выдержать 30 минут до полного растворения агарозы. Для приготовления агарозы можно использовать СВЧ-печь. Раствор охладить до 45-50 С и залить необходимый гель (длина рабочей зоны геля должна быть не менее 8 см). Агарозные гели можно приготовить за время проведения реакции ПЦР.

4.3.2 Электрофорез в агарозном геле

Детекция продуктов амплификации осуществляется электрофорезом в агарозном геле.

15-20 мкл реакционной смеси (ПЦР-продукт) из каждой пробирки смешать с 2 мкл буфера для нанесения образцов, внести в лунки агарозного геля и провести электрофорез при 10 в/см в течение 30-60 минут, бромфеноловый краситель должен пройти до нижней границы геля. Гель окрасить в водном растворе бромистого этидия (5 мкг/мл) в течение 30 минут, с последующей 20 минутной отмывкой в дистиллированной воде.

Внимание! Бромид этидия – канцерогенное соединение; работать только в перчатках, избегать попадания на кожу и слизистые, при попадании на кожу или слизистые тщательно промыть соответствующий участок водой.

Документация результатов проводится визуально при просмотре геля на УФ-трансиллюминаторе с длиной волны 254-360 нм и фотографировании гелей с использованием оранжевого светофильтра.

5 УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результат ПЦР-анализа учитывается по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических красно-оранжевых флюоресцирующих полос амплифицированной ДНК.

Положительный контрольный образец ДНК. Сигнал от положительного контроля виден как четыре фрагмента следующих размеров: 1250 п.н. (ген 16S rRNA), 480 п.н. (stx2-ген), 407 п.н. (ген rfb-O104), 300 п.н. (ген flicH4) (рис. 1)

Отрицательный контрольный образец: в амплификате отрицательного контрольного образца не должно наблюдаться красно-оранжевых флюоресцирующих полос, соответствующих ампликонам положительного контроля. Наличие таких полос свидетельствует о контаминации используемого набора реагентов. В этом случае необходимо повторное исследование. При проведении ПЦР белее 35 циклов возможно появление фрагмента 1250 п.н. гена 16S rRNA (следствие использования рекомбинантной Taq I –полимеразы).

Анализируемые клинические образцы:

- при наличии в пробе анализируемого образца ДНК E.coli серотипа O104:H4 в геле должны наблюдаться три красно-оранжевые флюоресцирующие полосы специфических фрагментов ДНК размером 480 п.н. (stx2-ген), 407 п.н. (ген rfb-O104) и 300 п.н. (ген flicH4), а также флюоресцирующая полоса, соответствующая фрагменту 1250 п.н. гена 16S rRNA (внутренний контроль) (рис. 1);

- при отсутствии в пробе анализируемого образца ДНК E.coli серотипа O104:H4 и наличии ДНК других бактерий в геле должна наблюдаться только одна флюоресцирующая полоса, соответствующая фрагменту 1250 п.н. гена 16S rRNA (внутренний контроль);

- отсутствие флюоресцирующей полосы, соответствующей фрагменту 1250 п.н. гена 16S rRNA, говорит об ингибировании реакции и необходимости повторного исследования или об отсутствии в данной пробе какой-либо бактериальной ДНК.

6 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Организация работ на этапах приема, разбора и первичной обработки материала, подготовки проб и выделения нуклеиновых кислот, а также обеззараживания проб проводится в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности и гельминтами». Работа на остальных этапах ПЦР-анализа проводится как с обеззараженным материалом.

7 УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ

Набор необходимо хранить при температуре 2-8 С в течение 6 месяцев.

Транспортирование: при температуре от 2 С до 8 С.

Приложение 4.

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов латексной диагностики для быстрой идентификации шига-токсинпродуцирующего штамма Escherichia coli O104:H4

1. Назначение и характеристика тест-системы

Латексная тест-система E. coli O104:H4 предназначена для экспресс-выявления и идентификации микробных клеток Escherichia coli O104:H4 при проведении лабораторных исследований и представляет собой набор из трех флаконов емкостью 5 мл.

Латексная тест-система E. coli O104:H4 обеспечивает типоспецифическое выявление и идентификацию микробных клеток E. coli O104:H4 в суспензиях, полученных из колоний микроорганизмов, выращенных на пластинках ГРМ-агара. Специфическими мишенями данного теста являются липополисахарид O104 и жгутиковый антиген H4.

2. Состав тест-системы

В состав «латексной тест-системы E. coli O104:H4» входят:

• 
  флакон 1 (латексный тест), содержит 0,5 % взвеси частиц монодисперсного полистирольного альдегидного латекса диаметром 0,65 мкм, сенсибилизированного иммуноглобулинами G, выделенными из сывороток крови кроликов, содержащих антитела к липополисахариду O104 и жгутиковому антигену H4 E. coli O104:H4;
  

• 
  флакон 2 (контрольный тест), содержит 0,5 % взвеси частиц монодисперсного полистирольного альдегидного латекса, сенсибилизированного иммуноглобулинами из сывороток крови не иммунизированных кроликов;
  
• 
  флакон 3 (позитивный контроль), содержит инактивированную нагреванием взвесь культуры E. coli O104:H4, концентрация 10 единиц по ОСО 42-28-85 П.
  

3. Принцип действия

Микробные клетки E. coli O104:H4, присутствующие в исследуемой пробе, взаимодействуют с латексными частицами, сенсибилизированными антителами против липополисахаридого антигена O104 и жгутикового антигена H4 с последующим образованием видимых агглютинатов.

4. Меры предосторожности

Подготовку материала для исследования проводят с соблюдением специальной техники безопасности в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами I-IV групп патогенности и возбудителями паразитарных болезней».

5. Проведение анализа

5.1. Материалы и оборудование

• 
  0,01 моль натрий-фосфатный буфер, рН 7,4 (ФБР);
  
• 
  механические дозаторы переменного объема, позволяющие отбирать объемы жидкости 0,1; 0,01 и 0,005 мл;
  
• 
  предметные стекла;
  
• 
  стеклянные палочки.
  

5.2. Анализируемые образцы

5.2.1. Подозрительные колонии микроорганизмов, выращенные на пластинках ГРМ-агара в аэрофильных условиях в течение 18-24 часов при температуре 37 С.

Примечание – Анализируемые образцы не подвергать автоклавированию.

5.3. Анализ

5.3.1. На предметное стекло нанести 20 мкл физиологического раствора, стеклянной палочкой снять часть колонии тестируемого штамма (исследуемый образец) и растереть в капле физиологического раствора до получения гомогенной суспензии.

5.3.2. Извлечь необходимое количество упаковок латексной тест-системы из холодильника и выдержать при комнатной температуре 20 минут.

Примечание – перед применением латексный тест тщательно суспендировать до гомогенного состояния.

5.3.3. К исследуемому образцу механическим дозатором нанести на предметное стекло 0,015 мл латексного теста (флакон № 1) и оба компонента осторожно перемешать стеклянной палочкой до получения гомогенной суспензии. Реакционную смесь на стекле инкубировать при комнатной температуре 2 минуты, периодически покачивая, а затем регистрировать результаты реакции.

5.3.4. Проверка качества контрольного теста. К 0,02 мл исследуемого образца, нанесенного на предметное стекло, добавить 0,015 мл контрольного теста (флакон № 2) и оба компонента осторожно перемешать стеклянной палочкой до получения гомогенной суспензии. Реакционную смесь на стекле инкубировать при комнатной температуре 2 минуты, периодически покачивая, а затем регистрировать результаты реакции.

5.3.5. Контроль специфичности латексного теста. К 0,02 мл позитивного контроля (флакон № 3), нанесенного на предметное стекло, добавить 0,015 мл латексного теста (флакон № 1) и оба компонента осторожно перемешать стеклянной палочкой до получения гомогенной суспензии. Реакционную смесь на стекле инкубировать при комнатной температуре 2минуты, периодически покачивая, а затем регистрировать результаты реакции.

6. Регистрация и учет результатов

Учет результатов по п. 5.3.3, 5.3.4 и 5.3.5 провести через 2 минуты, руководствуясь таблицей.

Таблица 1 – Интерпретация результата

Положительный результат	Наличие видимой четкой окрашенной агглютинации частиц при добавлении к исследуемому образцу латексного теста (флакон 1). Наличие видимой четкой окрашенной агглютинации частиц при добавлении к позитивному контролю (флакон 3) латексного теста (флакон 1). Отсутствие агглютинации, фон равномерно мутный при добавлении к исследуемому образцу контрольного теста (флакон 2).
Отрицательный результат	Отсутствие агглютинации, фон равномерно мутный при добавлении к исследуемому образцу латексного теста (флакон 1). Наличие видимой четкой окрашенной агглютинации частиц при добавлении к позитивному контролю (флакон 3) латексного теста (флакон 1).
Тест не работает	Отсутствие агглютинации, фон равномерно мутный при добавлении к позитивному контролю (флакон 3) латексного теста (флакон 1).

7. Условия хранения и эксплуатации латексной тест-системы

Набор реагентов тест - системы необходимо хранить в герметично закрытых флаконах в сухом защищенном от света месте при температуре 2-8 ºС. Допускается транспортировка набора реагентов при температуре 2-25 ºС в срок не более 7 суток.

Примечание – Не замораживать.

Срок годности – 1 год. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение настоящей инструкции по применению.

<< предыдущая страница   следующая страница >>