Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых

7.2. Выделение и идентификация E.coli O157:Н7/O157:H- из пищевых продуктов.

7.2.1. Взятие материала и подготовка его для лабораторного исследования.

При отборе и подготовке образцов различных видов пищевых продуктов к исследованию руководствуются МУК 4.2.2812-11, Москва, 2011, «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий – возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией», МУК 4.2.992-00 «Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E.coli O157:Н7» и МУ № 04-723/3 от 17.12.84 г «По микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями».

7.2.2. Исследование материала.

Выделение культур E.coli O157:Н7/O157:H^- из исследуемых образцов и их последующую идентификацию с помощью иммунохроматографических экспресс – тестов, реакции латексной агглютинации (РЛА) (для обнаружения серогруппы O157) и мультиплексной ПЦР-тест-системы, определение биохимических свойств культур проводят по той же схеме, как и в случае исследования клинических образцов (см. п.5.1.).

7.3. Схема выделения и идентификация E.coli O157:Н7/O157:H^-.

8. Выделение и идентификация энтерогеморрагических E.coli, «не относящихся к E.coli O157:Н7-» из клинического материала и пищевых продуктов.

8.1. Выделение и идентификация E.coli, «не относящихся к E.coli O157:Н7» из клинического материала.

8.1.1. Исследование материала.

Первый день исследований.

1) Исследуемый материал засевают на три чашки Петри с питательной средой для выделения энтеробактерий – агар Эндо, селективный агар Мак Конки с сорбитолом и на среды для предварительного обогащения энтеробактерий - SDS-бульон, МакКонки-бульон или среду №11.

Высев материала на дифференциально-диагностические плотные среды производят с таким расчетом, чтобы в каждой чашке или в сумме на трех чашках получить не менее 100 изолированных колоний энтеробактерий.

Посевы выращивают при 37°С в течение 18-24 часов.

Второй день исследований.

1) Просматривают результаты посевов на дифференциально-диагностических средах и оценивают морфологию выросших изолированных колоний энтеробактерий (определяют морфотип колоний). Затем на чашки Петри с питательным агаром засевают по три-пять колоний каждого морфотипа (на отдельные сектора среды). Число отсеянных изолятов при любом количестве морфотипов не должно быть менее 20. Посевы выращивают при 37°С в течение 18-24 часов.

2) Проводят анализ культур выросших на средах МакКонки и Левина с антибиотиками, селективном агаре МакКонки с сорбитолом, с помощью иммунохроматографических экспресс–тестов для определения энтерогеморрагических E.coli. Подготовку образца для анализа и постановку иммунохроматографического теста проводят в соответствии с инструкцией по применению (см. Приложение 2).

3) Используя мультиплексную ПЦР-тест-систему, проводят анализ смеси культур энтеробактерий, выросших на жидких накопительных средах (SDS-бульон, среда №11), на присутствие в них энтерогеморрагических эшерихий, «не относящихся к E.coli O157:Н7». Идентифицируют такие эшерихии на основании обнаружения в смеси энтеробактерий генов еае, stx1, stx2 (или только stx1 или stx2). Ген rfb, определяющий синтез антигена O157, в этой группе патогенов не обнаруживается. Следует также учитывать, что в отдельных случаях у энтерогеморрагических культур, «не относящихся к E.coli O157:Н7», может не обнаруживаться и ген еае.

При получении положительных результатов иммунохроматографических экспресс–тестов для определения энтерогеморрагических E.coli, в ПЦР (обнаружение генов еае, stx1, stx2) дают предварительный ответ на наличие в исследуемом образце клеток энтерогеморрагических эшерихий, «не относящихся к E.coli O157:Н7».

3) Производят высев культур энтеробактерий, выросших на жидких накопительных средах (SDS-бульон, среда №11 или аналоги), на чашки Петри со средой Эндо, МакКонки-агаром с сорбитолом (не менее чем на три чашки с каждой среды обогащения) с таким расчетом, чтобы получить не менее 100 изолированные колонии микроорганизмов. Посевы выращивают при 37 °С в течение 18-24 часов.

Третий день исследований.

1) С помощью ПЦР-исследований проводят анализ 3-5 смешанных в одной пробирке изолятов энтеробактерий каждого морфотипа, отобранного при прямом высеве исследуемого материала (см. Второй день исследований, п.1). Для получения более объективных результатов анализа, при любом количестве отобранных морфотипов, число изучаемых в ПЦР изолятов должно быть не менее 20.

Результатами ПЦР анализа смеси изолятов могут быть:

а) в смеси изолятов обнаруживают гены еае, stx1, stx2;

б) в смеси изолятов обнаруживают еае-ген и один из stx-генов;

в) в смеси изолятов обнаруживают только stx1- и stx2-гены (или один из них) и не обнаруживают ген еае.

При обнаружении в смеси изолятов одной из перечисленных выше комбинаций генов проводят дополнительную ПЦР с каждым из входящих в смесь трех-пяти изолятов. У каждого изолята, давшего положительную ПЦР, определяют биохимические свойства для подтверждения принадлежности его к виду E.coli.

2) Просматривают результаты посевов со сред накопления на среду Эндо (см. Второй день исследований п.3) и оценивают морфологию изолированных колоний энтеробактерий. Затем по три-пять колоний бактерий каждого морфотипа засевают на отдельные сектора питательного агара в чашках Петри. Число отсеянных изолятов, независимо от количества выявленных среди колоний морфотипов, должно составлять не менее 20. Посевы выращивают при 37 °С в течение 18-24 часов.

3) Проводят анализ культур выросших на средах МакКонки и Левина с антибиотиками, с помощью иммунохроматографических экспресс–тестов для определения энтерогеморрагических E.coli. Подготовку образца для анализа и постановку иммунохроматографического теста проводят в соответствии с инструкцией по применению (см. Приложение 2).

Четвертый день исследований.

1) Учитывают результаты изучения биохимических свойств изолятов, у которых с помощью ПЦР были обнаружены специфические для энтерогеморрагических эшерихий гены еае, stx1, stx2 (или только один из генов шига-токсинов) (см. Третий день исследований, п.1). В случае, если изолят по своим биохимическим свойствам соответствует виду E.coli, делают заключение о присутствии в анализируемом образце энтерогеморрагических эшерихий, «не относящихся к E.coli O157:Н7».

В том случае, если изолят по своим биохимическим свойствам соответствует виду E.coli, определяется положительный результат в иммунохроматографическом экспресс–тесте для определения энтерогеморрагических E.coli, но у культуре не обнаружен ген еае, а присутствуют лишь гены шига-токсинов, делают заключение о присутствии в анализируемом образце шига-токсинпродуцирующих эшерихий (STEC-культур).

При обнаружении в образце энтерогеморрагических изолятов эшерихий или STEC-изолятов, исследования прекращают, а выделенные культуры направляют в референс- центры для дальнейшего изучения.

Если у изученных штаммов с помощью ПЦР-исследований обнаружены гены еае, , stx1, stx2 или же эти гены в разной комбинации, но изоляты по своим биохимическим свойствам не могут быть отнесены к виду E.coli, делают заключение об отсутствии в исследуемом образце энтерогеморрагических или STEC-культур. Выделенные культуры с генами еае, stx1, stx2, но не относящиеся к виду E.coli, также направляют в референс - центры.

2) Если в четвертый день исследований по п.1 получены отрицательные результаты, продолжают поиск энтерогеморрагических эшерихий или STEC-культур среди изолятов энтеробактерий, выделенных из сред обогащения (см. Третий день исследований, п.2).

Изучение изолятов в ПЦР проводят по той же схеме, как это описано выше (см. Четвертый день исследований, п.1). Если в результате проведенного анализа идентифицированы культуры энтеробактерий с генами еае, stx1, stx2, изучают их биохимические свойства.

Пятый день исследований.

1) Учитывают результаты изучения биохимических свойств изолятов энтеробактерий с генами еае, stx1, stx2. В случае, если эти изоляты по биохимическим свойствам относятся к виду E.coli, то делают положительное заключение о наличии в исследуемом образце энтерогеморрагических эшерихий или STEC-культур.

Выделенные культуры направляют в референс – центры.

8.2. Выделение и идентификация E.coli, «не относящихся к E.coli O157:Н7», из пищевых продуктов.

8.2.1. Исследование материала.

Выделение энтерогеморрагических культур E.coli «не относящихся к E.coli O157:Н7» из исследуемых образцов и их последующую идентификацию в иммунохроматографических экспресс–тестах, с помощью мультиплексной ПЦР и определения биохимических свойств культур проводят по той же схеме, как и в случае исследования клинических образцов (см. п.6.1.).

8.3. Схема выделения и идентификации энтерогеморрагических эшерихий, «не относящихся к E.coli O157:Н7».

9. Организация лабораторных исследований на E.coli O104:H4 и О157:Н7 и другие энтерогеморрагические кишечные палочки.

В соответствии с утвержденными санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2885-11 «Дополнения и изменения № 2 к СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IVгрупп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», утвержденными постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.06.2011 № 86 (зарегистрированы в Минюсте России 30.06.2011, регистрационный номер 63953), дополнено приложение 1 «Классификация микроорганизмов – возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности» раздел «Бактерии», подраздел «II группа» следующим пунктом: Escherichia coli O157:H7, O104:H4 и другие серотипы – продуценты веротоксина (возбудители геморрагического колита, гемолитико-уремического синдрома). Таким образом, возбудители E.coli O104:Н4 и О157:Н7 относятся к II группе патогенности, и для работы с ними требуется наличие у лаборатории соответствующего санитарно-эпидемиологического заключения.

9.1. Общие требования

Все работы по сбору, транспортированию и подготовке проб клинического и секционного материала осуществляют в соответствии с требованиями СП 1.3.2322–08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СП 1.3.2518–09 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322–08», СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности», методических указаний МУ 1.3.2569 – 09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I – IV групп патогенности».

9.2. Координация деятельности учреждений, осуществляющих диагностику острых кишечных заболеваний, вызванных энтерогеморрагическими эшерихиями (STEC-культуры).
Лабораторные исследования на энтерогеморрагические кишечные палочки, в том числе E.coli O104:H4 и О157:Н7, проводят бактериологические лаборатории юридических лиц, независимо от организационно – правовых форм и форм собственности, в том числе центров гигиены и эпидемиологии, лечебно-профилактических, ведомственных и противочумных учреждений, имеющих санитарно – эпидемиологические заключения и лицензии на право работы с микроорганизмами II – IV и III – IV групп патогенности.

3.1. Показания к проведению исследований.

Исследования клинического материала проводятся в случае:

- Наличия у пациента гемолитико-уремического синдрома после (на фоне) перенесенного диарейного заболевания.

- Наличия у пациента гемолитической анемии после (на фоне) перенесенного диарейного заболевания.

- Наличия у пациента любого (по тяжести и синдромальному диагнозу) диарейного заболевания при наличии эпидемиологических данных о возможной связи заболевания с EHEC.

Исследования образцов продуктов питания проводятся по эпидемиологическим показаниям в соответствии с действующими нормативно-методическими документами.

Бактериологические лаборатории учреждений лечебно-профилактических и ведомственных служб, центров гигиены и эпидемиологии, имеющих санитарно – эпидемиологические заключения и лицензии на право работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности:

Проводят плановые диагностические исследования материала от больных острыми кишечными инфекциями, определенного контингента здоровых лиц и проб из объектов окружающей среды.

Забор материала от пациентов (или умерших) с подозрением на инфекционное заболевание, вызванное STEC-культурами, проводят в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ), в максимально ранние сроки до назначения антибактериальной терапии. В качестве клинического материала для исследований используют образцы фекалий. Для постмортальной диагностики используют содержимое кишечника, аутоптаты желудка, тонкого и толстого кишечника, почек. Сбор материала производят в пробирки с транспортной средой, предоставляемой (или рекомендуемой) фирмой-производителем тест-систем.

Исследования ведут до установления отрицательного результата анализа или выделения культур микроорганизмов, подозрительных на энтерогеморрагические кишечные палочки (положительные результаты при использовании иммунохроматографических экспресс–тестов для определения энтерогеморрагических E.coli, реакцией РЛА или ПЦР на E.coli O104:H4 и О157:Н7.

При подозрении на положительный результат выделения культур энтерогеморрагических кишечных палочек сотрудники лабораторий немедленно сообщают в Управление Роспотребнадзора в субъекте Российской Федерации. Для окончательной идентификации выделенные культуры по согласованию с Управлением Роспотребнадзора в субъекте Российской Федерации направляют в установленном порядке в лаборатории особо опасных инфекций центров гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации, имеющих санитарно – эпидемиологические заключения и лицензии на право работы с микроорганизмами II – IV групп патогенности.

Доставка материала производится транспортом лечебно-профилактических учреждений по согласованию с управлением Роспотребнадзора субъекта Российской Федерации с учётом оптимальной транспортной схемы

Лаборатории особо опасных инфекций центров гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации, имеющих санитарно – эпидемиологические заключения и лицензии на право работы с микроорганизмами II – IV групп патогенности:

- выполняют исследование материала от больных и умерших с подозрением на эшерихиозную инфекцию и объектов окружающей среды с целью индикации возбудителя;

- идентифицируют культуры, выделенные в лабораториях, определяя их таксономическую принадлежность, и эпидемическую значимость (токсигенность), а также чувствительность к антибиотикам;

- осуществляют (или организуют) бактериологический контроль качества питательных сред и других диагностических препаратов, используемых в лабораториях;

- представляют оперативную информацию о выделенных культурах в Управление Роспотребнадзора в субъекте Российской Федерации;

- контролируют деятельность территориальных лабораторий, оказывают им методическую помощь по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора.

При необходимости проведения оценки идентичности изолятов – направляют культуры EHEC в референс – центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней ФГУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, референс – центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций (ФГУН «Центральный научно – исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора) и референс – центр по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекционных болезней ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора) с учётом оптимальной транспортной схемы.

Референс – центры:

- проводят исследования материала или культур от больных и умерших с подозрением на заболевание эшерихиозом, а также объектов окружающей среды;

- подтверждают таксономическую принадлежность культур, выделенных на курируемой территории;

- проводят субвидовое типирование выделенных изолятов STEC-культур в соответствии с поставленными эпидемиологическими задачами с применением унифицированных протоколов анализа набора продуктов рестрикции тотальной ДНК в пульсирующем электрическом поле – пульс-электрофорез (PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis).

- идентифицируют все атипичные культуры с использованием дополнительных методов серологической, биохимической и других видов идентификации с целью уточнения таксономической принадлежности;

- определяют эпидемическую значимость (токсигенность) культур, с использованием комплекса регламентированных методов, антибиотикочувствительность;

- осуществляют методическое руководство по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора на курируемой территории;

- в установленном порядке передают с паспортами выделенные культуры в Государственную коллекцию патогенных бактерий ФБУН ГНЦ ПМБ.

Референс – центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций (ФГУН «Центральный научно – исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора) осуществляет ведение единой общероссийской базы данных по циркулирующим в Российской Федерации штаммам STEC-культур и их депонирование в Национальном центре верификации диагностической деятельности на базе ФГУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора.

Результаты исследований , проводимых на каждом уровне передают в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в управление Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации, в учреждение, направившее материал, в день получения результата.

Персонал лабораторий, выполняющих исследования на эшерихиозы, должен быть подготовлен по вопросам лабораторной диагностики, техники безопасности и обеспечен соответствующими инструктивно-методическими материалами.

Усовершенствование врачей-бактериологов и лаборантов по микробиологии и лабораторной диагностике эшерихиозов проводят на специальных курсах усовершенствования.

<< предыдущая страница следующая страница >>