Название работы	Кол-во страниц	Размер
Инструкция по применению «Микробиологическая диагностика заболеваний...	1	22.06kb.
Урок 11. Тема: Многообразие организмов. Бактерии. Элементы содержания...	1	48.68kb.
Методические указания к лабораторной работе по курсу «Теория волновых...	1	123.87kb.
Методические указания к лабораторной работе по курсу «Теория волновых...	1	109.46kb.
Методические указания к лабораторной работе по статистической радиофизике...	5	670.31kb.
Методические указания к лабораторной работе №14 Волгоград 2013 (076.	1	160.03kb.
Методические указания к лабораторной работе по курсу «Методы и средства...	1	242.39kb.
Инструкция по выполнению лабораторной работы по дисциплине "Химическое...	1	212.95kb.
Методические указания к лабораторной работе №1 по курсу " Основы...	1	166.16kb.
Практикум по экономике труда часть 1 Методические указания	4	703.96kb.
Методические указания к семинарским занятиям	1	236.28kb.
Обоснование различных схем очистки зерноочистительного агрегата,...	1	78.89kb.
Викторина для любознательных: «Занимательная биология»	1	9.92kb.

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование

Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические указания

по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых

Escherichia coli, продуцирующих шига-токсины (STEC-культуры),

и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в

пищевых продуктах.
Методические указания

МУК 4.2.2963-11

Издание официальное

Москва

2011

Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Escherichia coli, продуцирующих шига-токсины (STEC-культуры), и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах.

ISBN…..

1. 
   Разработаны:
   

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (И.В. Брагина, Е.Б. Ежлова, Ю.В. Демина, Н.В. Шеенков).

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора (И.А.Дятлов, Э.А.Светоч, Н.В. Воложанцев, Б.В. Ерусланов, В.Н.Баннов, М.В.Храмов, Е.В. Мицевич, И.П. Мицевич).

2. 
   Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 19 августа 2011.
   

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

Содержание

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации _______________________Г.Г.Онищенко «19» августа 2011 г. Дата введения: с момента утверждения.

4.2. Методы контроля.

Биологические и микробиологические факторы.
Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний,

вызываемых Escherichia coli, продуцирующих

шига-токсины (STEC-культуры),

и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах.
Методические указания

МУК 4.2.2963-11

__________________________________________________________________

1. Область применения.

1.1. Методические указания определяют схемы выделения из клинического материала и пищевых продуктов трех групп эшерихий, продуцирующих шига-токсины, и их идентификацию: а) E.coli O104:Н4, эпидемического штамма, вызвавшего вспышку STEC-инфекции в Германии и других странах весной 2011 года б) E.coli O157:Н7/O157:Н-, основного представителя группы энтерогеморрагических эшерихий; и в) энтерогеморрагических эшерихий, не относящихся к серовару E.coli O157:Н7˝

Ключевым поражающим фактором этих трех групп эшерихий являются шига-токсины - Stx1 и Stx2.

1.2. Методические указания предназначены для специалистов бактериологических лабораторий учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и других организаций, независимо от их организационно-правовой формы, имеющих санитарно – эпидемиологическое заключение и лицензию на работу с микроорганизмами I-IV групп патогенности.

Нормативно – методические документы

В настоящих методических указаниях использованы ссылки и положения следующих документов:

2.1. Федеральный закон “О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения” № 52–ФЗ от 30 марта 1999 г.

2.2. Закон Российской Федерации от 07.02.1992 г. № 2300-1 «О защите прав потребителей».

2.3. Федеральный закон от 02.01.2000 г. № 29-ФЗ «О качестве и безопасности пищевых продуктов».

2.4. “Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании”, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации № 554 от 24 июля 2000 г.

2.5. Приказ Минздрава СССР от 24.04.1985 № 535 "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений".

2.6. «Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)», утвержденные Решением Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 года № 299.

2.7. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".

2.8. СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)»

2.9. СП 1.3.2322-08"Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней и СП 1.3.2885-11  «Дополнения и изменения № 2 к СП 1.3.2322-08 «Безопасность  работы с микроорганизмами III-IVгрупп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

2.10. СанПиН 2.1.3.2630-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность"

2.11. МУК 4.2.992-00 «Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E.coli 0157:Н7».

2.12. МУК 4.2.2812-11, Москва, 2011, «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий – возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией»

2.13. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лаборатории, использующих методы амплификации НК при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IYгрупп патогенности».

2.14. Методы выявления патогенных микроорганизмов с использованием иммунохроматографических экспресс–тестов производства Merck (Германия): Методические рекомендации. – М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. – 23с.

2.15. Методические указания «МУ № 04-723/3 от 17.12.84 г «По микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями».

2.16. ГОСТ Р 52816-2007 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)».

2.17. ГОСТ Р 53430-2009 «Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа».

2.18. ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины, бара­нины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц".

2.19. ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы микробиологического анализа".

2.10. ГОСТ 4288-76 "Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рублен­ного мяса. Правила приемки и методы испытания".

2.21. ГОСТ Р 50396:0-92 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим, исследо­ваниям" .

2.22. ГОСТ 7702.2.2-93 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек".

2.23. ГОСТ Р ИСО 7218-2008 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям».

3. Общие положения.

3.1. Острые кишечные инфекции с проявлениями геморрагического колита (ГК) и гемолитикоуремического синдрома (HUS), вызываемые эшерихиями, продуцирующими шигатоксины (STEC), распространены во многих странах мира и регистрируются в виде спорадических случаев или вспышек с охватом больших количеств людей: от десятков до нескольких тысяч.

Среди штаммов Е.coli особое значение имеют патогенные штаммы, синтезирующие веротоксины (шигаподобные токсины). Выделяется группа энтерогеморрагических штаммов Е.coli (EHEC) с высокопатогенными сероварами O157:Н7, O26, O103, O111, O145 и др. Продукция веротоксинов является наиболее общий критерием для определения данной группы бактерий. Веротоксины можно классифицировать по основным группам: веротоксины 1 (VT1, SLT1, Stx1) и веротоксины 2 (VT2, SLT2, Stx2). Штаммы EHEC способны продуцировать либо только токсины первой (VT1) или второй группы (VT2), либо обе группы токсинов (VT1) и (VT2) одновременно.

Резервуаром данной инфекции являются крупный рогатый скот, козы и овцы. Загрязнение пищевых продуктов происходит в процессе их приготовления при неудовлетворительном состоянии гигиены на производстве, а также при недостаточной термической обработке продуктов.

3.2. Люди заболевают STEC-инфекциями после употребления недоброкачественных мясных продуктов, непастеризованного молока, йогуртов, сыра, овощей, шпината, разных салатов, пророщенных зерен бобовых, соков, других пищевых продуктов и воды, обсемененных STEC-бактериями. Возможно заражение людей при контакте с сельскохозяйственными и домашними животными, а также при непосредственном контакте с больными STEC-инфекцией. Штаммы EHEC представляют серьезную угрозу жизни особенно для пожилых людей и детей до 5 лет.

Наиболее частый путь распространения инфекции - фекально-оральный.

Инкубационный период при STEC-инфекции – в среднем от трех до восьми дней.

Основными клиническими симптомами при STEC-инфекциях являются острые абдоминальные боли, диареи, часто с кровью (геморрагический колит), рвота, тошнота, температура может быть незначительно повышена. Большинство заболевших выздоравливает в течение 5-10 дней без каких-либо осложнений. У части больных (до 30 %) спустя неделю после начала диареи может развиться гемолитико-уремический синдром (HUS). Основные симптомы HUS – снижение частоты мочеиспускания, чувство сильной усталости, анемия кожи и слизистых. У больных с HUS развивается острая почечная недостаточность, гемолитическая анемия и тромбоцитопения. Лечение больных с HUS для клиницистов является непростой задачей, поскольку антимикробная терапия STEC-инфекций пока не разработана. Смертность среди больных HUS высокая и колеблется от 3 до 30 %. У переболевших людей может отмечаться непродолжительный период бактерионосительства.

3.3. Настоящие методические указания определяют алгоритм выделения из клинического материала и пищевых продуктов и идентификации эшерихий, продуцирующих веротоксины (шигаподобные токсины): а) серовара O104:Н4, возбудителя эпидемической вспышки геморрагического колита и HUS в Германии и других странах весной 2011 года; б) энтерогеморрагического серовара O157:Н7/O157:Н^-; и в) сероваров, «не относящихся к O157:Н7»

Выделение указанных патогенов проводят на дифференциально-диагностических питательных средах с последующим исследованием чистых культур в реакции латексной агглютинации (РЛА), или методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле, или их дальнейшей идентификацией на иммунохроматографическом тесте с применением питательного бульона для индукции синтеза веротоксинов (содержащий индуктор синтеза веротоксинов – карбадокс).

3.4. Серовар O157:Н7/O157:Н^- является доминирующим представителем энтерогеморрагической группы эшерихий, наиболее часто вызывающих геморрагический колит и HUS у людей во многих странах мира.

Источником и основным резервуаром этого патогена являются сельскохозяйственные животные: крупный рогатый скот, овцы, козы, свиньи и птица, а также дикие животные. Носительство этого серовара среди сельскохозяйственных животных в России составляет от 2 до 3 процентов.

По культурально-морфологическим свойствам штаммы серовара O157:Н7/O157:Н^- - типичные представители вида E.coli, но имеют некоторые биохимические особенности: не образует β-Д-глюкоронидазу и не ферментирует многоатомный спирт сорбитол. Эти свойства патогена используют при его выделения из клинического материала и пищевых продуктов.

Основными факторами патогенности серовара O157:Н7/O157:Н^- являются веротоксины (шигаподобные токсины) Stx1 и Stx2 (или только Stx2), белок интимин, ответственный за адгезию возбудителя к эпителиальным клеткам кишечника, энтерогемолизин и жгутиковый антиген Н7. Перечисленные факторы патогенности детерминируются соответственно генами stx1, stx2, eae, hly и flic. Указанные гены, а также rfb гены, ответственные за синтез соматического О антигена, являются основными генами-мишенями для диагностических ПЦР-тест-систем, используемых при идентификации серовара E.coli O157:Н7/O157:Н^-.

3.5. Причиной геморрагического колита и HUS у человека, помимо серовара O157:Н7/O157:Н^-, могут выступать энтерогеморрагические эшерихии других серологических О-групп, хотя их удельный вес в структуре STEC-инфекций значительно меньше, чем серовара O157:Н7/O157:Н^-. В настоящее время уже насчитывается более 25 таких сероваров E.coli. Среди этой группы STEC-патогенов чаще всего от больных выделяют эшерихии серогрупп O26, O111, O55, O103, O45, O121, O113, O117 и O145.

Группа этих возбудителей, в отличие от серовара O157:Н7/O157:Н^-, не имеет каких-либо фенотипических маркеров, которые можно было бы использовать в качестве селективных при высеве анализируемых образцов на питательные среды. Это обстоятельство значительно затрудняет выделение и идентификацию возбудителей геморрагического колита и HUS, «не относящихся к O157:Н7».

В геноме этой группы патогенов, как правило, обнаруживают гены синтеза интимина – еае и гены веротоксинов (шигаподобных токсинов) – stx1 и stx2 (либо только stx1 или stx2). Поэтому реально диагностировать группу STEC штаммов «не относящихся к O157:Н7», возможно либо только по обнаружению у них способности продуцировать шига-токсины, либо по индикации у них генов stx1 и stx2.

3.6. Серовар E.coli O104:Н4, явившийся причиной крупной эпидемической вспышки геморрагического колита и тяжелых случаев HUS в Германии и других странах Европы весной- летом 2011 года, и охватившей более 4000 человек, по своим культуральным, биохимическим и другим фенотипическим свойствам является типичным представителем вида E.coli. Однако его генотип существенно отличается от генотипа «классического» представителя группы энтерогеморрагических эшерихий – E.coli O157:Н7/O157:Н^-: он не содержит генов интимина (eae), вероцитотоксинов (шигаподобных токсинов) 1-го типа (Stx1) и энтерогемолизина. Его геном на 93 % идентичен геному штамма E.coli 55989, относящемуся к группе энтероаггрегативных эшерихий (EAEC), возбудителей диареи у человека, выделенному в Центральной африканской республике. Однако в отличие от энтероаггрегативных штаммов в геноме штамма E.coli O104:Н4 присутствует ген синтеза веротоксина (шигаподобного токсина) 2-го типа (Stx2), то есть генотип этого высоковирулентного для человека штамма вобрал в себя факторы патогенности энтероаггрегативных эшерихий (способность к аггрегации и образованию биопленки на слизистой кишечника) и энтерогеморрагических (способность к синтезу веротоксина (шигаподобного токсина) Stx2 – основного фактора, обусловливающего HUS у человека). Кроме того, эпидемический штамм E.coli O104:Н4 характеризуется широким спектром устойчивости к антибактериальным препаратам: к бета-лактамам – ампициллину, амоксициллину/клавулонату, пиперациллину/сульбактаму, пиперациллину/тазобактаму, цефуроксину, цефуроксиму, цефокситину, цефотаксиму, цефтазидиму, цефподоксиму, а также к стрептомицину, налидиксовой кислоте, тетрациклину и триметоприму/сульфаметоксазолу. Устойчивость к бета-лактамам обусловлена присутствием в геноме штамма бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) - СТХ-М-15 и ТЕМ-1. Наличие у штамма E.coli O104:Н4 маркеров резистентности к антибиотикам может быть использовано при его выделении из клинического материала и пищевых продуктов.

4. Правила сбора клинического (секционного) материала

Взятие материала от клинически больных и контактных и его доставка в лабораторию для исследования осуществляется в соответствии с МУК 4.2.992-00 «Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E.coli O157:Н7» и МУ № 04-723/3 от 17.12.84 г «По микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями».

4.1 Сбор клинического материала и его упаковку осуществляет медицинский работник лечебно-профилактического учреждения, обученный требованиям и правилам биологической безопасности при работе и сборе материала, подозрительного на зараженность энтерогеморрагическими эшерихиями (STEC-культуры) E.coli O104:H4. Забор производят в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры, стерильными инструментами. Все виды работ проводят с соблюдением противоэпидемического режима, согласно СП 1.3.2322–08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»

4.2. Процедуры по забору клинического материала обученный медицинский персонал осуществляет в резиновых перчатках. После процедуры отбора материала перчатки обрабатываются растворами дезинфицирующих средств, руки после снятия перчаток обрабатываются антисептиками в соответствии с СП 1.3.2322–08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

От одного больного должно забираться не менее трех видов клинического материала. Обязательно следует забирать пробы фекалий, промывные воды из желудка. Каждый образец материала помещают в отдельную транспортную емкость.

Для постмортальной диагностики используют аутоптаты желудка, тонкого и толстого кишечника, печени, селезенки, красного костного мозга.

4.3. Сбор материала производят в пробирки с транспортной средой, предоставляемой (или рекомендуемой) фирмой-производителем тест-систем.

5. Упаковка и транспортирование образцов
5.1. Все материалы, доставляемые в лабораторию, должны быть герметично упакованы в соответствии с СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности» и настоящих методических указаний:

1) в транспортную емкость (плотно закрывающиеся пластмассовые пробирки или флаконы с завинчивающимися крышками); плотно закрытый верхний конец транспортной емкости вместе с крышкой герметизируют различными пластификаторами (парафин, парафильм и др.); емкость маркируют;

2) в полиэтиленовый пакет подходящего размера с ватой (или другим гигроскопичным материалом) в количестве достаточном для адсорбции всего образца в случае его утечки; полиэтиленовый пакет следует герметично заклеить или запаять;

5.1.1 Образцы от одного пациента могут быть упакованы в один полиэтиленовый пакет. Не допускается упаковывание образцов материалов от разных людей в один и тот же пакет.

5.1.2 В полиэтиленовый пакет вкладывают бланк направления с указанием: наименование направляющего учреждения, ФИО больного, возраст, место жительства, предварительный диагноз, эпидемиологический анамнез, вид материала, дата и время взятия материала.

5.2 Герметично закрытые полиэтиленовые пакеты помещают в термоизолирующий плотно закрывающийся контейнер (термос), приспособленный для транспортирования биологических материалов.

5.2.1 В термоконтейнеры и термосы помещают охлаждающие элементы или пакеты со льдом. К наружной стенке термоконтейнера или термоса прикрепляют этикетку с указанием вида материала, условий транспортирования, названия пункта назначения.

5.3 Транспортирование проб клинического материала в референс-лаборатории, лаборатории центров гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации и лаборатории учреждений противочумной системы Роспотребнадзора осуществляется нарочным(и), информированным о правилах доставки материала в соответствии с п.3.4. СП 1.2.036-95.

следующая страница >>