Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых

6. Выделение и идентификация эпидемического штамма E.coli O104:Н4 из клинического материала и пищевых продуктов.

6.1. Выделение и идентификация E.coli O104:Н4 из клинического материала.

6.1.1. Исследование материала.

Первый день исследований.

1) Исследуемый материал засевают на дифференциально-диагностические плотные питательные среды МакКонки и Левина с антибиотиками: цефотаксимом (25 мкг/мл) и налидиксовой кислотой (4 мкг/мл), селективный агар с сорбитолом, а также на жидкие питательные среды: питательную среду для выделения и идентификации энтеробактерий - SDS-бульон, МакКонки-бульон или питательную среду для предварительного обогащения бактерий семейства Enterobacteriaceae – среду №11 с теми же антибиотиками: цефотаксимом (25 мкг/мл) и налидиксовой кислотой (4 мкг/мл).

Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18-24 часов.

Посевы на плотные среды производят таким образом, чтобы получить изолированный рост колоний кишечной палочки.

Приготовление указанных выше сред с антибиотиками см. в Приложении 1.

Второй день исследований.

1) Со сред МакКонки и Левина с антибиотиками отсевают по 10 типичных для E.coli колоний на отдельные сектора питательного агара (среда №1-ГРМ,СПА или аналог), разлитого в чашки Петри (по 10 изолятов на одну чашку). Посевы выращивают при 37 °С в течение 18-24 часов.

2) Проводят анализ культур выросших на средах МакКонки и Левина с антибиотиками, на селективном агаре с сорбитолом, с последующим индукцией синтеза веротоксинов на питательном бульоне, содержащий индуктор синтеза веротоксинов – карбадокс, с дальнейшим определением веротоксинов с помощью иммунохроматографических экспресс–тестов для определения энтерогеморрагических E.coli. Подготовку образца для анализа и постановку иммунохроматографического теста проводят в соответствии с инструкцией по применению (см. Приложение 2). При получении положительных результатов в иммунохроматографическом тесте дают предварительный ответ на наличие в исследуемом образце энтерогеморрагических кишечных палочек.

3) Проводят анализ культур, выросших на бульоне с антибиотиками, с помощью диагностической мультиплексной ПЦР-тест-системы, предназначенной для индикации клеток штамма E.coli O104:Н4 по наличию в генов rfb, stx2 и flic. Подготовку образца для анализа и постановку ПЦР проводят в соответствии с Инструкцией по ее применению (см. Приложение 3).

При получении положительных результатов в ПЦР дают предварительный ответ на наличие в исследуемом образце клеток штамма E.coli O104:Н4.

4) Проводят высев культур микроорганизмов, выросших на SDS-бульоне и других бульонах, на чашки Петри со средами МакКонки и Левина, содержащих цефотаксим (25 мкг/мл) и налидиксовую кислоту (4 мкг/мл), селективный агар с сорбитолом с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии E.coli. Посевы выращивают при 37 °С в течение 18-24 часов.

Третий день исследований.

1) Проводят анализ культур выросших на средах МакКонки и Левина с антибиотиками, селективном агаре с сорбитолом, с последующим индукцией синтеза веротоксинов на питательном бульоне, содержащий индуктор синтеза веротоксинов – карбадокс и определении веротоксинов с помощью иммунохроматографических экспресс–тестов для определения энтерогеморрагических E.coli.. Подготовку образца для анализа и постановку иммунохроматографического теста проводят в соответствии с инструкцией по применению (см. Приложение 2). При получении положительных результатов в иммунохроматографическом тесте дают предварительный ответ на наличие в исследуемом образце энтерогеморрагических кишечных палочек.

2) Используя антительную латексную тест-систему для индикации эшерихий серогруппы O104, в реакции латексной агглютинации (РЛА) среди 20 выросших на питательном агаре изолятов проводят поиск культур серогруппы O104. Постановку РЛА проводят согласно Инструкции по ее применению (см. Приложение 4). Давшие положительную реакцию агглютинации с латексным диагностикумом изоляты в этот же день анализируют с помощью мультиплексной ПЦР-тест-системы согласно инструкции по ее применению (см. Приложение 3). Одновременно у культур, которые по результатам РЛА были отнесены к серогруппе O104, изучают биохимические свойства и определяют у них чувствительность к антибиотикам (см. Приложение 5).

3) Проводят пересев 20 типичных для E.coli изолятов, выросших на средах МакКонки и Левина с антибиотиками, селективном агаре с сорбитолом (после пересева культур со сред обогащения - SDS-бульона и др.) на отдельные сектора чашек Петри с питательным агаром (по 10 изолятов на чашку).

Четвертый день исследований.

1) В случае, если при положительном иммунохроматографическом тесте, ПЦР-анализе в культурах изолятов, полученных прямым высевом из образца (см. Второй день исследований, п.1.) и давших положительную реакцию агглютинации с латексным диагностикумом (см. Третий день исследований, п.1.)и, был обнаружены культуры, продуцирующие веротоксин, или были идентифицированы гены rfb, stx2 и flic, специфичные для эпидемического штамма E.coli 0104:H4, и культуры по своим биохимическим свойствам соответствуют виду E.coli, то делают заключение об обнаружении эпидемического штамма E.coli O104:Н4 в анализируемом образце. В этом случае все дальнейшие исследования образца прекращают, а изолированные культуры E.coli O104:Н4 пересылают для дальнейшего их изучения в референс – центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней ФГУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, референс – центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций (ФГУН «Центральный научно – исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора) и референс – центр по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекционных болезней ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора) (далее референс-центры) с учётом оптимальной транспортной схемы.

В том случае, если ни один из 20 изолятов, полученных при прямом высеве анализируемого материала на среды МакКонки и Левина с антибиотиками, на селективный агар с сорбитолом не дали положительную реакцию на наличие энтеротоксинов, определяемых в экспрессном иммунохроматографическом тесте, не дали положительную реакцию в РЛАи ПЦР – исследовании, работу с этими изолятами прекращают, а их культуры уничтожают.

2) Продолжают работать с 20 изолятами, полученными со сред обогащения (см. Третий день исследований, п.1.). У изолятов определяют наличие веротоксинов после инкубации на питательном бульоне, содержащий индуктор синтеза веротоксинов – карбадокс (и далее тестируют с помощью иммунохроматографических экспресс–тестов, изучают серологические свойства в РЛА, предназначенной для идентификации серогруппы E.coli O104.

В случае обнаружения изолятов, давших положительную реакцию на наличие веротоксинов в иммунохроматографическом тесте, положительную реакцию агглютинации в РЛА, их анализируют в ПЦР для обнаружения в геноме исследуемых изолятов специфических для E.coli O104:Н4 генов rfb, stx2 и flic. У этих же изолятов изучают биохимические свойства и чувствительность к антибиотикам.

Пятый день исследований.

1) В случае, если при ПЦР-анализе в культурах изолятов, давших положительную реакцию агглютинации с латексным диагностикумом, были идентифицированы гены rfb, stx2 и flic, специфичные для штамма E.coli O104:H4, а культуры по своим биохимическим свойствам соответствуют виду E.coli, то делают заключение об обнаружении эпидемического штамма E.coli O104:Н4 в анализируемом образце.

В этом случае все дальнейшие исследования образца прекращают, образец уничтожают, а изолированные культуры E.coli O104:H4 пересылают для дальнейшего их изучения в референс – центры.

В том случае, если ни одна из 20 культур, полученных со сред обогащения, не была отнесена к серогруппе O104, работу с этими изолятами прекращают, а их культуры уничтожают.

Делается заключение об отсутствии в исследуемом материале эпидемического штамма E.coli O104:H4.

6.2. Выделение и идентификация E.coli 0104:H4 из пищевых продуктов.

6.2.1. Взятие материала и пересылка его для лабораторного исследования.

При отборе и подготовке образцов различных видов пищевых продуктов к исследованию руководствуются МУК 4.2.2812-11, Москва, 2011, «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий – возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией».

6.2.2. Исследование материала.

Выделение культур E.coli O104:H4 из исследуемых образцов пищевых продуктов и их последующую идентификацию с помощью имунохроматографических экспресс – тестов на веротоксины, реакции латексной агглютинации (РЛА) и мультиплексной ПЦР, определение биохимических свойств и чувствительности культур к антибиотикам проводят по той же схеме, как и в случае исследования клинических образцов (см. п.6.1.).

6.3.Схема выделения и идентификации E.coli O104:Н4

7. Выделение и идентификация эпидемического штамма E.coli O157:Н7/O157:H- из клинического материала и пищевых продуктов.

7.1. Выделение и идентификация E.coli O157:Н7/O157:H- из клинического материала.

7.1.1. Исследование материала.

Первый день исследований.

1) Исследуемый материал засевают на среду для выделения и дифференциации E.coli O157:Н7/O157:H^- - Сорбитол-E.coli O157:Н7-агар или МакКонки сорбитол агар и параллельно на обычный агар Эндо или МакКонки агар, а также на жидкие питательные среды - SDS-бульон и др.

Прямой высев анализируемого образца на Сорбитол-E.coli O157:Н7-агар или идентичные среды необходимо производить не менее чем на три чашки Петри с таким расчетом, чтобы на пластинках среды вырастали десятки, сотни изолированных колоний микроорганизмов. Получение большого количества колоний на дифференциальной среде повышает вероятность обнаружения и выделения серовара E.coli O157:Н7/O157:H^-.

Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18-24 часов.

Второй день исследований.

1) Среди выросших колоний на Сорбитол-E.coli O157:Н7-агаре отбирают неокрашенные сорбитолнегативные колонии, характерные для E.coli O157:Н7, и засевают их на отдельные сектора в чашки Петри с питательным агаром. При наличии большого количества неокрашенных колоний необходимо отсеять не менее 20 изолятов (по 10 на чашку). Посевы выращивают при 37 °С в течение 18-24 часов.

2) С помощью иммунохроматографических экспресс– тестов определения E.coli O157:Н7/O157:H^- или иммунохроматографических экспресс–тестов для определения энтерогеморрагических E.coli проводят анализ культур, выросших на твёрдых питательных средах. Подготовку образца для анализа и постановку иммунохроматографических экспресс тестов проводят в соответствии с инструкцией по их применению (см. Приложение 6).
3) С помощью мультиплексной ПЦР (набор «ТЭК-O157» или аналоги), предназначенной для индикации клеток E.coli O157:Н7/O157:H^- по наличию в них генов rfb, еае, stx1, stx2 (или только stx1 или stx2), проводят анализ смеси культур, выросших на SDS-бульоне или других жидких средах. Подготовку образца для анализа и постановку ПЦР проводят в соответствии с Инструкцией по ее применению (см. Приложение 7).

При получении положительных результатов иммунохроматографических экспресс – тестов или в ПЦР - исследовании дают предварительный ответ на наличие в исследуемом образце клеток энтерогеморрагического серовара E.coli O157:Н7/O157:H^-.

3) Проводят пересев культур микроорганизмов, выросших на жидких средах, на чашки Петри со средой Сорбитол-E.coli O157:Н7-агар, (по три чашки из каждой среды) с таким расчетом, чтобы получить десятки и сотни изолированные колонии микроорганизмов. Посевы выращивают при 37 °С в течение 18-24 часов.

Третий день исследований.

1) Используя иммунохроматографические экспресс – тесты определения E.coli O157:Н7/O157:H^-, антительную латексную тест-систему для индикации E.coli серогруппы O157, в реакции латексной агглютинации (РЛА) среди выросших на питательном агаре изолятов, полученных из неокрашенных сорбитолнегативных колоний (взятых после прямого посева образца с Сорбитол-E.coli 0157:Н7-агара, проводят поиск культур E.coli серогруппы O157. Постановку РЛА проводят согласно Инструкции по ее применению (см. Приложение 8). Давшие положительную реакцию в иммунохроматографических экспресс – тестах определения E.coli O157:Н7/O157:H^- или реакции агглютинации с латексным диагностикумом культуры в этот же день анализируют с помощью мультиплексной ПЦР-тест-системы. Одновременно у культур, которые по результатам РЛА были отнесены к серогруппе O157, изучают биохимические свойства.

2) Производят пересев сорбитолнегативных неокрашенных колоний, выросших на Сорбитол- E.coli O157:Н7-агаре или идентичных средах (после пересева культур со сред обогащения), на отдельные сектора пластинок питательного агара, разлитого в чашки Петри. При наличии на Сорбитол-E.coli O157:Н7-агаре большого количества сорбитолнегативных колоний необходимо отсеять для последующих исследований не менее 20 изолятов (по 10 колоний на чашку).

Четвертый день исследований.

1) В случае, если при ПЦР-анализе в культурах изолятов, выделенных прямым высевом анализируемого образца на Сорбитол-E.coli O157:Н7-агар и давших положительную реакцию в иммунохроматографических экспресс – тестах для определения E.coli O157:Н7/O157:H^- или агглютинации с латексным диагностикумом, были идентифицированы гены rfb, еае, stx1 и stx2 (или только stx1 или stx2), специфичные для серовара E.coli O157:Н7/O157:H^-, и культуры по своим биохимическим свойствам соответствуют виду E.coli, то делают заключение об обнаружении в анализируемом материале клеток энтерогеморрагического серовара E.coli O157:Н7/O157:H^-. В этом случае все дальнейшие исследования образца прекращают, а изолированные культуры E.coli O157:Н7/O157:H^- пересылают для дальнейшего их изучения в референс – центры.

В том случае, если ни один из изолятов, полученных при прямом высеве анализируемого материала на Сорбитол-E.coli O157:Н7-агар, не дал положительную реакцию в иммунохроматографических экспресс – определения E.coli O157:Н7/O157:H^- или РЛА, работу с этими изолятами прекращают, а их культуры уничтожают.

2) У сорбитолнегативных изолятов, полученных со сред обогащения (см. Третий день исследований, п.2.), определяют принадлежность к E.coli O157:Н7/O157:H^- на иммунохроматографических экспресс – тестах, изучают серологические свойства в РЛА, предназначенной для идентификации E.coli серогруппы O157.

В случае обнаружения изолятов, давших положительную реакцию на иммунохроматографических экспресс – тестах, положительную реакцию агглютинации в РЛА, их анализируют в ПЦР для обнаружения в их геноме специфических для E.coli O157:Н7/O157:H^- генов rfb, еае, stx1и stx2 (или только stx1 или stx2). У этих же изолятов изучают биохимические свойства.

Пятый день исследований.

1) В случае, если при ПЦР-анализе в культурах изолятов, давших положительную реакцию на иммунохроматографических экспресс – тестах, положительную реакцию агглютинации с латексным диагностикумом, были идентифицированы гены rfb, еае, stx1, stx2 (или только stx1 или stx2), специфичные для E.coli O157:Н7/O157:H^-, и культуры по своим биохимическим свойствам соответствуют виду E.coli, то делают заключение об обнаружении штамма E.coli O157:Н7/O157:H^- в анализируемом образце.

В этом случае все дальнейшие исследования образца прекращают, образец уничтожают, а изолированные культуры E.coli O157:Н7/O157:H^- пересылают для дальнейшего их изучения в референс – центры.

В том случае, если ни один из изолятов, полученных со сред обогащения, не был отнесен к серогруппе O157, работу с этими изолятами прекращают, а их культуры уничтожают.

Делается заключение об отсутствии в исследуемом материале бактерий энтерогеморрагического серовара E.coli O157:Н7/O157:H^-.
следующая страница >>