Похожие работы
|
Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых - страница №6/6
Приложение 5.Определение чувствительности культур E. coli к антибиотикам.Чувствительность штаммов E.coli к антибиотикам диско-диффузионным методом (ДДМ или методом дисков) определяют согласно Методическим указаниям МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» Принцип метода ДДМ определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам основан на способности антибактериальных препаратов (АБП) диффундировать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганизмов, посеянных на поверхности агара. Приготовление питательных сред для определения чувствительности Для оценки чувствительности культуры E.coli к антибиотикам необходимо использовать только специально предназначенные для этой цели среды. Каждую партию плотных питательных сред перед применением необходимо проверять на пригодность для роста тестируемых микроорганизмов. Для этого используются соответствующие контрольные штаммы, например, E.coli ATCC 25922 или E.coli ATCC 38218. Внутрилабораторный контроль качества среды необходимо проводить при использовании всех известных коммерчески доступных питательных сред, независимо от их производителя. Выбранная питательная среда для определения чувствительности готовится из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования питательную среду охлаждают до 48–500С и разливают по чашкам слоем толщиной 4 мм (на чашку диаметром 100 мм 25 мл агара, на чашку диаметром 90 мм - 20 мл). Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания агара. Приготовленные указанным образом питательные среды предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при +4 – +80С в течение 5 суток. Из суточной культуры E.coli ATCC 25922 или E.coli ATCC 38218 (или другой культуры) готовят микробную взвесь, соответствующую по плотности 0,5 по стандарту МакФарланда (содержащую приблизительно 1,5х108 КОЕ/мл), затем из этой взвеси готовят серию последовательных десятикратных разведений. На приготовленные чашки с проверяемой средой высевают по 0,1 мл взвеси -5, -6, -7 разведений, содержащих соответственно 1х103, 1х102, 1х101 КОЕ/мл. При хороших питательных свойствах среды должен отмечаться рост микроорганизмов из -6, -7 разведений. Интегральный контроль качества определения чувствительности Наиболее доступным интегральным методом оценки качества определения чувствительности патогенов к антибиотикам является сопоставление результатов определения чувствительности (диаметров зон подавления роста) контрольных (референтных) штаммов микроорганизмов с соответствующими показателями, приведенными в их паспортной характеристике. Тестирование контрольных штаммов проводят в соответствии с описанными выше методами, параллельно тестированию клинических изолятов. Диски с антибиотиками Для получения правильных результатов определения чувствительности ДДМ необходимо строго соблюдать правила хранения и использования коммерческих дисков, в противном случае содержание в них антибиотиков может снизиться ниже допустимого уровня (прежде всего в результате увлажнения) еще до истечения срока годности. Долговременное хранение дисков с АБП осуществляется в герметичной упаковке в морозильной камере при температуре –18оС и ниже. Небольшие партии дисков, используемые при повседневной работе, можно хранить в холодильнике при температуре +4 – +80С, плотно укупоренными так, чтобы гарантировать невозможность попадания во флакон влаги, кроме того для дополнительной защиты от влаги во флаконах (картриджах) с дисками коммерческого изготовления содержится специальный влагопоглотитель (силикагель). Флаконы (картриджи) с дисками следует извлекать из холодильника за 1 ч до начала работы и выдерживать герметично закрытыми до достижения ими комнатной температуры, что предотвращает образование конденсата на дисках после открывания флаконов. Внимание! Для получения достоверных результатов используйте диски отечественных производителей на средах АГВ или типа АГВ производства филиала «Питателные среды г. Махачкала ООО «Микроген» и ФБУН ГНЦПМБ, а среду Мюллер-Хинтона только с импортными дисками. Приготовление бактериальной суспензии и инокуляция При определении чувствительности ДДМ используют стандартный инокулюм, соответствующий по плотности 0,5 по стандарту МакФарланда и содержащий примерно 1,5х108 КОЕ/мл. Инокулюм следует использовать в течение 15 минут после приготовления. Для засева приготовленных чашек с питательной средой стандартный инокулюм наносят пипеткой на поверхность агаровой пластинки чашки Петри в объеме 1-2 мл, равномерно распределяют взвесь микроорганизмов по поверхности питательной среды покачиванием, после чего удаляют избыток инокулюма пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Аппликация дисков и инкубация Не позднее, чем через 15 мин после инокуляции тестируемого микроба на поверхность питательной среды наносят диски с АБП. Аппликацию дисков проводят с помощью стерильного пинцета или автоматического диспенсера. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков с АБП. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом. Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри с посевами помещают в термостат и инкубируют при температуре 37оС в течение 18-24 ч. Увеличение интервала времени между нанесением дисков на поверхность среды и началом инкубации (а соответственно – началом роста исследуемой культуры микроорганизма) приводит к "преддиффузии" АБП в агар и к увеличению диаметра зоны подавления роста. После окончания инкубации чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 450 (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста измеряют с точностью до 1 мм, предпочтительнее пользоваться штангенциркулем или кронциркулем. При измерении зон задержки роста испытуемой культуры следует учитывать лишь зону полного подавления видимого роста бактерий. Не следует обращать внимания на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны задержки роста тестируемого микроба только при особых условиях освещения или увеличении, и едва заметный налет у края зоны Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны подавления роста тестируемого микроба, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или о гетерорезистентности популяции микроорганизмов, в этом случае необходимо повторить идентификацию микроорганизма, формирующего эту колонию, и определение чувствительности этого штамма. В таблице приведена антибиотикограмма штамма E.coli O104:H4 и интерпретация результатов определения чувствительности E.coli к антибиотикам по величине зон подавления роста испытуемого штамма. Справочная таблица для определения чувствительности к антибиотикам штаммов E.coli, подозрительных на принадлежность их к STEC O104:H4
* - для фосфомицина в питательную среду необходимо добавить глюкозо-6-фосфат до концентрации 25 мкг/мл Приложение 6ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮИммунохроматографического экспресс-теста для определения энтерогеморрагических E.coli O157 Принцип работы иммунохроматографического теста основан на взаимодействии антигенов, находящихся в образце исследуемого материала с антителами, меченными золотом (Singlepath® E.coli O157 или аналог). Иммунохроматографический тест представляет собой диагностическую тест-панель с круглой лункой для добавления образца, овальным окном с тестовой (Т) и контрольной (С) зонами.
Чувствительность метода - 1 клетка (КОЕ) E.coli O157 в 25 г образца Ограничения метода
Условия хранения Иммунохроматографический тест для определения E.coli O157 стабилен до даты, указанной на упаковке, при хранении в условиях +2-8оС. Проведение анализа
Проведение тестирования
Интерпретация результатов
Приложение 7ИНСТРУКЦИЯПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯСПЕЦИФИЧЕСКИХ УЧАСТКОВ ДНК ЭНТЕРОГЕМОРРАГИЧЕСКИХ ESCHERICHIA COLI O157 В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУРАХИ КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
Набор предназначен для выявления специфических участков ДНК энтерогеморрагических Escherichia coli в бактериальных культурах, клиническом материале и пищевых прокуктах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.
Набор содержит компоненты, необходимые для проведения ПЦР, в результате которой происходит амплификация фрагментов генов интимина (eaeA), шига-токсина 1 (stx1), шига-токсина 2 (stx2), гена rfb, контролирующего синтез первичных боковых цепей ЛПС (определяют серогруппу O157). Получаемая в результате ПЦР комбинация из этих фрагментов позволяет выявлять и дифференцировать различные токсин-продуцирующие штаммы энтерогеморрагических E. coli. В качестве внутреннего контроля используется дополнительная пара праймеров на консервативную область гена 16S rRNA. Это позволяет учесть возможное ингибирование реакции и исключить ложно-отрицательный результат. 2.1 Принцип действия В основе метода лежит полимеразная цепная реакция с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. Детекция продуктов амплификации осуществляется электрофорезом в агарозном геле. 2.2 Состав набора (на 100 реакций) - ПЦР-буфер - 2 пробирки по1,2 мл -Taq-POL (Taq I –полимераза) - 40 мкл - смесь Мульти O157 - 500 мкл - dNTP (смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов) - 50 мкл - dH2O (деионизованная вода) - 400 мкл - мин. масло (минеральное масло) - 2,0 мл - O157+ (положительный контроль) - 100 мкл 3. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ
4 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 4.1. Приготовление образцов для анализа в ПЦР: бактериальные клетки суспендировать в 100 мкл стерильной дистиллированной воды до концентрации 107 – 109 кл/мл в пробирках 1,5 мл типа «Эппендорф». Пробы прогреть при температуре 98 ºС в течение 15 минут (твердотельный термостат или водяная баня). Центрифугировать 5 минут при 2000-3000 g (4000-6000 об/мин.). Для многократного использования хранить при температуре минус 20 оС. Для приготовления образцов из клинического материала использовать коммерческие наборы для выделения ДНК из клинического материала. 4.2 Проведение ПЦР 1. Перед проведением ПЦР-анализа внести в одну или обе (в зависимости от объема исследования) пробирки «ПЦР-буфер» по 20 мкл фермента TaqI-полимеразы из пробирки «Taq-POL». Полученной смеси «ПЦР-буфер+» в каждой пробирке достаточно для проведения ПЦР-анализа 50 образцов. Смесь ПЦР-буфера с TaqI-полимеразой «ПЦР-буфер+» можно хранить при температуре + 4 ºС не более 6 мес. Отдельные компоненты «ПЦР-буфер» и «Taq-POL» можно хранить при минус 20 ºС в течение 1 года. 2. Перенести содержимое пробирки «dNTP» в пробирку «смесь Мульти O157» . Полученную смесь «Мульти O157 с dNTP», рассчитанную на 100 реакций, можно хранить при температуре + 4 ºС в течение 6 мес. 3. Включить охладитель проб (для охлаждения штативов с пробирками можно использовать ледяные блоки). 4. В охлажденный штатив расставить ряд пробирок для ПЦР (0,5 мл). Количество пробирок должно соответствовать количеству анализируемых образцов с учетом двух дополнительных пробирок, предназначенных для отрицательного и положительного контролей. 5. Внести на дно каждой пробирки по 20 мкл смеси «ПЦР-буфер+» (ПЦР-буфер с Taq I –полимеразой, п.1). 6 Добавить во все пробирки по 5 мкл раствора «смесь Мульти O157 с dNTP» (п.2). 7. Добавить во все пробирки по одной капле (~20 мкл) минерального масла. Если используется термоциклер с подогреваемой крышкой, то минеральное масло не добавлять. 8. В пробирку для отрицательного контроля внести 5 мкл деионизованной воды - «dH2O». 9. В пробирки для исследуемых образцов внести по 5 мкл лизатов клеток или 5 мкл образцов, выделенных из клинических проб. 10. В пробирку для положительного контроля внести 5 мкл раствора «O157+» 11. Все пробирки встряхнуть на вортексе, жидкость осадить на дно пробирок кратковременным откручиванием на вортекс-центрифуге. Пробирки поместить в блок термоциклера после прогрева прибора в режиме паузы при 95°С (режим горячего старта). 12. Провести реакцию амплификации по программе: 1-й цикл: 95°С - 5 мин, 58°С - 1 мин, 73°С - 1 мин; далее 30-40 циклов: 94°С – 30 сек, 60°С – 30 сек, 72°С – 30 сек; в конце: 1 цикл: 72°С - 3 мин, 10°С – охлаждение (хранение). При тестировании лизатов клеток достаточно 30 циклов реакции. 13. После окончания реакции амплификации пробирки отправить в комнату для анализа продуктов ПЦР. Пробы после амплификации можно хранить в течение нескольких дней при 4-8 °С и несколько месяцев при минус 20 °С. 4.3 Анализ продуктов ПЦР 4.3.1 Приготовление агарозных гелей для электрофореза Трис-боратный буфер (ТБЕ) для электрофореза: готовится концентрированный (пятикратный) буфер 5×ТБЕ (54 г Трис-осн., 27 г борной кислоты, 20 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0 растворяется в 1 л дистиллированной воды), который разводится перед проведением анализа (к 200,0 мл 5×ТБЕ добавить 800,0 мл дистиллированной воды). Буфер для нанесения образцов (десятикратный): 0,025 г бромфенолового синего; 4 мл глицерина; 5 мл 0,5 M ЭДТА, pH 8,0; довести до 10 мл дистиллированной водой. Раствор 1,5 % агарозы: взвесить 1,5 г агарозы, растворить в 100 мл ТБЕ буфера, поставить в кипящую водяную баню и выдержать 30 минут до полного растворения агарозы. Для приготовления агарозы можно использовать СВЧ-печь. Раствор охладить до 45-50 С и залить необходимый гель (длина рабочей зоны геля должна быть не менее 8 см). Агарозные гели можно приготовить за время проведения реакции ПЦР. 4.3.2 Электрофорез в агарозном геле Детекция продуктов амплификации осуществляется электрофорезом в агарозном геле. 15-20 мкл реакционной смеси (ПЦР-продукт) из каждой пробирки смешать с 2 мкл буфера для нанесения образцов, внести в лунки агарозного геля и провести электрофорез при 10 в/см в течение 30-60 минут, бромфеноловый краситель должен пройти до нижней границы геля. Гель окрасить в водном растворе бромистого этидия (5 мкг/мл) в течение 30 минут, с последующей 20 минутной отмывкой в дистиллированной воде. Документация результатов проводится визуально при просмотре геля на УФ-трансиллюминаторе с длиной волны 254-360 нм и фотографировании гелей с использованием оранжевого светофильтра. 5 УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ Результат ПЦР-анализа учитывается по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических красно-оранжевых флюоресцирующих полос амплифицированной ДНК.. Положительный контрольный образец ДНК. Сигнал от положительного контроля виден как пять фрагментов следующих размеров: 1250 п.н. (ген 16S rRNA), 690 п.н. - (eae-ген), 480 п.н. - (stxII-ген), 400 п.н. - (rfb-ген), 330 п.н. - (stxI-ген) (рис. 1). Отрицательный контрольный образец: в амплификате отрицательного контрольного образца не должно наблюдаться красно-оранжевых флюоресцирующих полос, соответствующих ампликонам положительного контроля. Наличие таких полос свидетельствует о контаминации используемого набора реагентов. В этом случае необходимо повторное исследование. При проведении ПЦР белее 35 циклов возможно появление фрагмента 1250 п.н. гена 16S rRNA (следствие использования рекомбинантной Taq I –полимеразы). Анализируемые образцы. - при наличии в пробе анализируемого образца ДНК возбудителя геморрагического колита в геле должны наблюдаться четыре красно-оранжевые флюоресцирующие полосы специфических фрагментов ДНК размером 690 п.н. - (ген eae), 480 п.н. - (ген stx2), 400 п.н. - (ген rfb) и 330 п.н. - (ген stx1), а также флюоресцирующая полоса, соответствующая фрагменту 1250 п.н. гена 16S rRNA (внутренний контроль) (рис. 1); - при отсутствии в пробе анализируемого образца ДНК шига-токсин содержащих E.coli серогруппы O157 и наличии ДНК бактерий других видов в геле должна наблюдаться только одна флюоресцирующая полоса, соответствующая фрагменту 1250 п.н. гена 16S rRNA (внутренний контроль); - отсутствие флюоресцирующей полосы, соответствующей фрагменту 1250 п.н. гена 16S rRNA, говорит об ингибировании реакции и необходимости повторного исследования или об отсутствии в данной пробе какой-либо бактериальной ДНК. 6 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ Организация работ на этапах приема, разбора и первичной обработки материала, подготовки проб и выделения нуклеиновых кислот, а также обеззараживания проб проводится в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности и гельминтами». Работа на остальных этапах ПЦР-анализа проводится как с обеззараженным материалом. 7 УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАТАЦИИ НАБОРА Набор необходимо хранить при температуре 2-8 С в течение 6 месяцев. Транспортирование: при температуре от 2 С до 8 С. Приложение 8ИНСТРУКЦИЯпо применению набора реагентов латексной диагностики для быстрой идентификации возбудителя геморрагического колита Escherichia coli O157:H71. Назначение и характеристика тест-системы Тест системана для экспресс-выявления и идентификации микробных клеток Escherichia coli O157:H7 при проведении лабораторных исследований и представляет собой набор из трех флаконов емкостью 5 мл. Тест система обеспечивает типоспецифическое выявление и идентификацию микробных клеток E. coli O157:H7 в суспензиях, полученных из колоний микроорганизмов, выращенных на пластинках ГРМ-агара. Специфическими мишенями данного теста являются липополисахарид O157 и жгутиковый антиген H7 E. coli O157:H7. 2. Состав тест-системы В состав тест системы входят:
3. Принцип действия Микробные клетки E. coli O157:H7, присутствующие в исследуемой пробе, взаимодействуют с латексными частицами, сенсибилизированными антителами против липополисахаридого антигена O157 и жгутикового антигена H7 с последующим образованием видимых агглютинатов. 4. Меры предосторожности Подготовку материала для исследования проводят с соблюдением специальной техники безопасности в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами I-IV групп патогенности и возбудителями паразитарных болезней». 5. Проведение анализа 5.1. Материалы и оборудование
5.2. Анализируемые образцы 5.2.1. Подозрительные колонии микроорганизмов, выращенные на пластинках ГРМ-агара в аэрофильных условиях в течение 18-24 часов при температуре 37 С. Примечание – Анализируемые образцы не подвергать автоклавированию. 5.3. Анализ 5.3.1. На предметное стекло нанести 20 мкл физиологического раствора, стеклянной палочкой снять часть колонии тестируемого штамма(исследуемый образец) и растереть в капле физиологического раствора до получения гомогенной суспензии. 5.3.2. Извлечь необходимое количество упаковок латексной тест-системы из холодильника и выдержать при комнатной температуре 20 минут. Примечание – перед применением латексный тест тщательно суспендировать до гомогенного состояния. 5.3.3. К исследуемому образцу механическим дозатором нанести на предметное стекло 0,015 мл латексного теста (флакон № 1) и оба компонента осторожно перемешать стеклянной палочкой до получения гомогенной суспензии. Реакционную смесь на стекле инкубировать при комнатной температуре 2 минуты, периодически покачивая, а затем регистрировать результаты реакции. 5.3.4. Проверка качества контрольного теста. К 0,02 мл исследуемого образца, нанесенного на предметное стекло, добавить 0,015 мл контрольного теста (флакон № 2) и оба компонента осторожно перемешать стеклянной палочкой до получения гомогенной суспензии. Реакционную смесь на стекле инкубировать при комнатной температуре 2 минуты, периодически покачивая, а затем регистрировать результаты реакции. 5.3.5. Контроль специфичности латексного теста. К 0,02 мл позитивного контроля (флакон № 3), нанесенного на предметное стекло, добавить 0,015 мл латексного теста (флакон № 1) и оба компонента осторожно перемешать стеклянной палочкой до получения гомогенной суспензии. Реакционную смесь на стекле инкубировать при комнатной температуре 2минуты, периодически покачивая, а затем регистрировать результаты реакции. 6. Регистрация и учет результатов Учет результатов по п. 5.3.3, 5.3.4 и 5.3.5 провести через 2 минуты, руководствуясь таблицей. Таблица 1 – Интерпретация результата
7. Условия хранения и эксплуатации латексной тест-системы Набор реагентов тест системы необходимо хранить в герметично закрытых флаконах в сухом защищенном от света месте при температуре 2-8ºС. Допускается транспортировка набора реагентов тест системы при температуре 2-25 ºС в срок не более 7 суток. Срок годности – 1 год. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение настоящей инструкции по применению. << предыдущая страница |
|