Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых

Приложение 1.

Приготовление питательных сред с антибиотиками для селективного

выделения изолятов E.coli O104:H4 из клинического материала

и пищевых продуктов.

В качестве селективных питательных сред для выделения Escherichia coli O104:H4 из исследуемого материала используют: плотные дифференциально-диагностические среды МакКонки и Левина и жидкие накопительные среды SDS-бульон, TSB-бульон и среду №11 ГРМ, в которые добавлены антибиотики цефотаксим (25 мкг/мл) и налидиксовая кислота (4 мкг/мл).

Указанные выше среды готовят согласно прописи производителя:

агар МакКонки-ГРМ – 25 г порошка растворить в 500 мл дистиллированной воды, кипятить в течение 3 мин и стерилизовать автоклавированием при 121 ° С (1 атм.) в течение 15 мин.
агар Левина-ГРМ – 17 г порошка растворить в 500 мл дистиллированной воды, кипятить в течение 2-3 мин, профильтровать через ватно-марлевый фильтр и стерилизовать автоклавированием при 110° С (0,5 атм.) в течение 20 мин.
SDS-бульон – 3.2 г порошка растворить в 100 мл дистиллированной воды Прокипятить 1-2 мин. Не автоклавировать.
Среда №11 ГРМ – 27,08 г препарата размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение 2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют автоклавированием при температуре 121° С в течение 15 минут.

Приготовленные среды охладить до температуры 40-45° С и внести в них растворы антибиотиков до конечной концентрации: цефотаксима – 25 мкг/мл, налидиксовой кислоты – 4 мкг/мл. Разлить агар по чашкам, а бульон – в колбы в количестве 100 мл.

Приготовление антибиотиков:

Цефотаксим (ОАО «Биосинтез», Россия или аналог).

Антибиотик взвешивают на аналитических или торсионных весах в количестве 100 мг и растворяют навеску в 10 мл дистиллированной воды. Получают концентрацию препарата 10 мг/мл

вносят антибиотик в объеме 0,25 мл на 100 мл среды (конечная концентрация 25 мкг/мл) или
1,25 мл на 500 мл среды (конечная концентрация 25 мкг/мл)
Налидиксовая кислота («Неграм» KRKA, Словения, или аналог).

На аналитических или торсионных весах взвешивают 16 мг антибактериального препарата и растворяют его в 5 мл дистиллированной воды, в которую по каплям при постоянном перемешивании вносят 1N раствор NaOH до полного растворения препарата и доводят общий объем дистиллированной водой до 10 мл. Получают концентрацию препарата 1,6 мг/мл

вносят антибактериальный препарат в объеме 0,25 мл на 100 мл среды (конечная концентрация 4 мкг/мл) или
1,25 мл на 500 мл среды (конечная концентрация 4 мкг/мл)

На указанных выше средах с антибиотиками хорошо вырастает культура Е.coli O104:H4, но подавляется рост энтеробактерий, чувствительных к цефотаксиму и налидиксовой кислоте.
Приложение 2

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ

Иммунохроматографического экспресс-теста для определения энтерогеморрагических E.coli.
Иммунохроматографический экспресс-тест, который выявляет наличие веротоксинов (шигоподных токсинов), продуцируемых энтерогеморрагическими (EHEC) патогенными штаммами Е.coli (включая E.coli O157:H7), при выделении из пищевых продуктов.
Принцип работы иммунохроматографического теста основан на взаимодействии антигенов, находящихся в образце исследуемого материала с антителами, меченными золотом. Иммунохроматографический тест (Duopath^® Verotoxins или аналоги) представляет собой диагностическую тест-панель с круглой лункой для добавления образца, овальным окном с тестовыми зонами (VТ1) и (VT2) и контрольной (С) зоной.

Образец добавляется в круглую лунку.
Образец адсорбируется подложкой и взаимодействует со специфичными к веротоксинам (VT1) и (VT2) антителами.
В присутствии антигенов (веротоксинов) образуется комплекс с меченными антителами, который мигрирует до зоны связывания в тестовой зоне (VT1) и (VT2).
Зоны связывания (VT1) и (VT2) содержат соответствующие антитела к комплексу антиген-антитело. В результате образуется четкая красная линия в одной зоне (VT1) (наличие веротоксинов группы 1) или в другой зоне (VT2) (наличие веротоксинов группы 2) или в двух зонах сразу при наличии веротоксинов обеих групп (VT1) и (VT2).
Оставшийся образец продолжает движение к контрольной зоне (С) и образует четкую красную линию, указывающую на то, что тест работает правильно.

Чувствительность метода – нижний предел обнаружения веротоксинов составляет 25 нг/мл для веротоксинов группы 1 (VT1) и 62,5 нг/мл для веротоксинов группы 2 (VT2).

Условия хранения

Иммунохроматографические тесты стабильны до даты, указанной на упаковке, при хранении в условиях +2-8^оС.

Проведение анализа
(I) Выявление энтерогеморрагических E.coli в образцах пищевых продуктов

Смешать 25 г (мл) образца с 225 мл среды обогащения. Выбор среды обогащения зависит от типа продукта. Среда для молочных продуктов – модифицированный триптиказо-соевый бульон с новобиоцином. Среда для мясных продуктов - модифицированный бульон ЕС с новобиоцином.
При необходимости гомогенизировать образец. Инкубировать триптиказо-соевый бульон с новобиоцином в течение 18-24 ч при 37^оС, а модифицированный бульон ЕС с новобиоцином в течение18-24 ч при 41,5^оС.
Со среды обогащения посеять на Макконки агар с сорбитолом и инкубировать в течение 18-24 ч при 37^оС.
Выбрать 1-5 характерные колонии E.coli со Макконки агара с сорбитолом.
Ресуспендировать колонии в 1 мл бульона с добавкой индуктора синтеза веротоксинов.
Инкубировать в течение 6 часов при 37^оС.
Перенести 180 мкл культуральной жидкости бульона с добавлением индукторов синтеза веротоксинов в пластиковую пробирку (эппендорф).
К флакону с полимиксином В добавить 1 мл стерильной дистиллированной воды.
Добавить 20 мкл раствора полимиксина В к 180 мкл культуральной жидкости с бульоном с добавкой индуктора синтеза веротоксинов и перемешать. Инкубировать в течение 10 минут при 37^оС.
Дать остыть до комнатной температуры.

Примечание. На агаре Мак – Конки с сорбитолом и селективной добавкой СТ способны расти только штаммы E.coli O157. Для определения синтеза веротоксинов от других сероваров E.coli, должен быть заменен на Макконки агар с сорбитолом или агар с сердечно-мозговой вытяжкой.

Проведение тестирования

Перед использованием обогащенный образец и иммунохроматографический тест должны быть комнатной температуры (обычно тесты хранятся в холодильнике).
Вскрыть пакет из фольги, в который упакован тест.
Положить тест на ровную поверхность и отмаркировать (указать номер исследуемого образца). Тестирование должно быть проведено в течение 2 часов после вскрытия фольги!
Используя микропипетку и одноразовый наконечник, добавить 150 мкл охлажденной культуральной жидкости в круглую лунку для образца.
Считать результаты через 20 минут после добавления образца.

Интерпретация результатов

Результаты теста учитываются только при наличии четкой красной линии в контрольной зоне (С) через 20 минут.
Образец считается положительным, если после 20 минут или ранее красные линии образовались как в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), так и в контрольной (С) зоне.
Образец считается отрицательным, если красная линия отсутствует в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), но присутствует в контрольной зоне (С).
Тест следует повторить, если красные линии отсутствуют как в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), так и в контрольной зоне (С) через 20 минут.

(II) Выявление энтерогеморрагических E.coli из клинического материала

Посеять клинический материал (фекалии) на агар Мак Конки с сорбитолом и инкубировать 18-24 часа при 37^оС.
Снять тампоном выросшие на агаре колонии, пересекая несколько раз зону сливного роста.
Ресуспендировать колонии в 1 мл бульона с добавкой индуктора синтеза веротоксинов. Инкубировать в течение 6 часов при 37^оС.
Перенести 180 мкл культуральной жидкости бульона с добавкой индуктора синтеза веротоксинов в пластиковую пробирку (эппендорф).
К флакону с полимиксином В добавить 1 мл стерильной дистиллированной воды. Добавить 20 мкл раствора полимиксина В к 180 мкл культуральной жидкости с CAYE-бульоном и перемешать. Инкубировать в течение 10 минут при 37^оС.
Дать остыть до комнатной температуры.

Проведение тестирования

Перед использованием обогащенный образец и иммунохроматографический тест должны быть комнатной температуры (обычно тесты хранятся в холодильнике).
Вскрыть пакет из фольги, в который упакован тест.
Положить тест на ровную поверхность и отмаркировать (указать номер исследуемого образца). Тестирование должно быть проведено в течение 2 часов после вскрытия фольги!
Используя микропипетку и одноразовый наконечник, добавить 150 мкл охлажденной культуральной жидкости в круглую лунку для образца.
Считать результаты через 20 минут после добавления образца.

Интерпретация результатов

Результаты теста учитываются только при наличии четкой красной линии в контрольной зоне (С) через 20 минут.
Образец считается положительным, если после 20 минут или ранее красные линии образовались как в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), так и в контрольной (С) зоне.
Образец считается отрицательным, если красная линия отсутствует в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), но присутствует в контрольной зоне (С).
Тест следует повторить, если красные линии отсутствуют как в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), так и в контрольной зоне (С) через 20 минут.

Бульон для индукции токсинов энтерогеморрагических E.coli

Принцип действия

Казаминовые кислоты и дрожжевой экстракт ускоряют рост веротоксин-продуцирующих штаммов E.coli. Микроэлементы и высокое значение рН также поддерживают синтез веротоксинов.

Состав среды (г/л) (CAYE – бульон или аналог)

Казаминовые кислоты 20,0; дрожжевой экстракт 6,0; глюкоза 2,5; хлорид натрия 2,5; гидрофосфат калия двузамещенный 8,71; сульфат магния 0,05; хлорид марганца 0,005.

Приготовление

Растворить 7,95 г среды в 200 мл дистиллированной воды и нагреть на кипящей водяной бане регулярно помешивая до полного растворения среды. Автоклавировать при 121^оС 15 минут. Охладить среду до комнатной температуры. В асептичных условиях добавить один флакон приготовленной добавки (для индукции синтеза веротоксинов), перемешать; разлить по 1 мл при перемешивании в стерильные пробирки. рН: 8,5 ± 0,2 при 25^оС. Приготовленный бульон светло-коричневого цвета, прозрачный. Осадок, который иногда может образоваться, не влияет на качество среды.

Проведение анализа

Отобрать 5-6 типичных колоний со среды выделения и инокулировать в пробирки с бульоном. Инкубировать 6 часов при 37^оС без перемешивания.

Контроль качества

Тест-штаммы	Продукция веротоксинов
Escherichia coli O157:H7 43889	VT1 (-)	VT2 (+)
Escherichia coli O157:H7 43890	VT1 (+)	VT2 (-)
Escherichia coli O157:H7 43888	VT1 (-)	VT2 (-)
Escherichia coli O157:H7 43885	VT1 (+)	VT2 (+)

<< предыдущая страница следующая страница >>