Конспект лекций Красноярск 2013

Декарбоксилирование. Декарбоксилирование глюкозо-6-фосфата с образованием рибулозо-5-фосфат представляет собой исходную реакцию пентозофосфатного пути расщепления углеводов:

глюкозо-6-фосфат – СО₂ → рибулозо-5-фосфат.

Декарбоксилирование начинается с двух последовательных реакций, катализируемых двумя НАДФ – зависимыми дегидрогеназами:

-глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой, ее продуктом является 6-фосфогюконат и 6-фосфатдегидрогеназой:

глюкозо-6-фосфат → 6-фосфогюконат - СО₂ → рибулозо-5-фосфат.

Декарбоксилирование происходит на второй ступени.

Нуклеотидные производные сахаров. Центральную роль в взаимопревращениях моносахаридов играют сахарнуклеотиды. Сахарнуклеотиды представляют большой интерес как доноры гликозильной группы в синтезе сахаров, с другой стороны они играют важную роль в превращениях моносахаридов как таковых. Эпимеризация глюкозы в галактозу катализируется УДФ-галактозо-4-эпимеразой. Субстратом служит УДФ глюкоза:

УДФ- глюкоза ↔ УДФ- галактоза.

В растениях найдены изомеразы, катализирующие, катализирующие взаимопревращения уроновых кислот:

УДФ-D-глюкуроновая кислота ↔ УДФ-D-галактуроновая кислота,

а также ксилозы и арабинозы:

УДФ-D-ксилоза ↔ УДФ-L-арабиноза.

Возможно образование УДФ-галактозы из УДФ-глюкозы и галактозы-1-фосфата:

УДФ-глюкоза + галактозо-1-фосфат ↔ УДФ-галактоза + глюкозо-1-фосфат. Реакцию катализирует УДФ-трансфераза.

УДФ-глюкуроновая кислота и УДФ-галактуроновая кислота могут превращаться в соответствующие УДФ-пентозы путем ферментативного декарбоксилирования:

УДФ-глюкуроновая кислота – СО₂ ↔ УДФ-D-ксилулоза

УДФ-галактуроновая кислота – СО₂ ↔ УДФ-L-арабиноза.

Ферментативное восстановление сахаров с образованием дезоксисахаров происходит при участии нуклеотидных производных сахаров.

В растениях широко распространена сахароза, играющая большую роль в обмене веществ у растений. Синтез сахарозы в растениях происходит путем реакции трансгликозилирования.

У пшеницы, кукурузы, бобов и других имеется фермент сахарозосинтаза, катализирующая реакцию:

УДФ-глюкоза + фруктоза ↔ УДФ + сахароза.

У шпината, сахарной свеклы обнаружен фермент – сахарозофосфат-синтаза, катализирующий синтез сахарозо-6-фосфата:

УДФ-глюкоза + фруктозо-6-фосфат ↔ УДФ + сахарозо-6-фосфат.

УДФ-глюкоза играет важную роль в синтезе гликозидов.

При участии УДФ-гюкозы или АДФ-глюкозы происходит синтез крахмала.
Лекция 4

Восстановительный пентозофосфатный цикл

План лекции

1. История открытия цикла Кальвина.

2. Карбоксилирование.

3. Восстановление

4. Регенерация.

5. Основные характеристики карбоксилирования.

История открытия цикла Кальвина. Образующиеся в процессе фотофосфорилирования АТФ и восстановленный НАДФ могут использоваться для осуществления различных реакций в хлоропластах. Наиболее мощный потребитель этих продуктов – это процесс фотосинтетического усвоения СО₂.

Изучение химизма фиксации СО₂ имеет большую историю. Долгое время общепринятой была гипотеза Байера, в основе которой лежало представление о фоторазложении углекислого газа с образованием окиси углерода (СО) и затем формальдегида, способного конденсироваться с образованием сахаров.

Работы Ван-Ниля и особенно Виноградова и Тейс, а также Рубена заставили отвергнуть точку зрения о фоторазложении СО₂ и сделали более вероятной идею о восстановлении углекислого газа.

Химизм фиксации СО₂ удалось расшифровать лишь после использования метода радиоактивных индикаторов. Первые работы в этом направлении были проведены Рубеном, применившим изотоп углерода С¹¹ с очень коротким периодом полураспада, который составлял всего 20 минут. В связи с этим опыты с С¹¹ имели ряд неудобств. Но не смотря на это удалось выдвинуть ряд принципиальных положений:

- установлено, что усвоение СО₂ начинается с реакции карбоксилирования альдегидной группы неизвестного соединения;

- процессам фотофосфорилирования отводилась решающая роль в фиксации СО₂.

Последнее положение полностью подтвердилось через несколько лет, после того как Кальвин с сотрудниками в Калифорнийском университете в Беркли стали использовать для изучения химизма фотосинтеза удобный радиоактивный изотоп углерода С¹⁴, имеющий период полураспада 5720 лет, что позволило заняться детальным исследованием превращения продукта фиксации СО₂. В 1946 – 1953 годы Кальвин и его сотрудники: Бенсон и Бэссхем расшифровали механизм фотосинтетической ассимиляции СО₂. В 1961 году за это фундаментальное открытие Кальвин был награжден Нобелевской премией. Кальвину удалось показать, что 3-фосфоглицерат является первым стабильным продуктом фиксации СО₂. Фиксация СО₂ происходит в циклическом процессе, который получил название цикла Кальвина.

Восстановительный пентозофосфатный цикл (цикл Кальвина) является основным путем усвоения углекислого газа растениями. Этот цикл представляет собой важнейший способ поглощения СО₂ фотосинтезирующими растениями. Цикл Кальвина – универсальный цикл для всех фотоавтотрофных зеленых растений.

Ферменты, катализирующие реакции цикла Кальвина, локализованы в строме хлоропластов. Только в трех реакциях цикла из тринадцати требуются кофакторы: АТФ и восстановленный НАДФ, которые должны регенерироваться в световых реакциях фотосинтеза, протекающих в тилакоидах. В самом цикле нет фотохимических стадий, однако световые реакции могут опосредованно влиять на реакции пентозофосфатного цикла, не требующие АТФ и восстановленного НАДФ.

Цикл Кальвина локализован в хлоропластах, однако продукты этого цикла могут транспортироваться в цитоплазму (рис. 4.1).

Рис. 4.1. Цикл Кальвина

Цикл Кальвина слагается из следующих этапов:

- карбоксилирование,

- восстановление,

- регенерация.

Карбоксилирование. Центральным звеном или ключевой реакцией цикла Кальвина является взаимодействие углекислого газа с рибулезо-1,5-дифосфатом (РуБФ). Реакция катализируется рибулезодифосфат-карбоксилазой (РуБФ-карбоксилаза). На этом этапе образуется две молекулы 3-фосфоглицериновой кислоты (ФГК). В этой реакции равновесие сильно сдвинуто в сторону ФГК:

Рибулезо-1,5-дифосфат + СО₂ + Н₂О → 2∙ 3-фосфоглицерат.

В результате этой реакции СО₂ присоединяется к рибулезо-1,5-дифосфату с образованием в качестве промежуточного продукта нестабильного сахара с шестью углеродными атомами, который затем распадается на две молекулы 3-фосфоглицерата (рис. 4.2).

Рис. 4.2. Превращение рибулезо-1,5-дифосфат в 3-фосфоглицерат

Эта реакция сложна и осуществляется в несколько этапов (рис. 4.3):

Рис. 4.3. Этапы превращения рибулезо-1,5-дифосфат в 3-фосфоглицерат

Рибулезо-1,5-дифосфат таутомеризуется и переходит в енольную форму.

2) В дальнейшем енольная форма рибулезо-1,5-дифосфата карбоксилируется по второму атому углерода с образованием промежуточного продукта β-кетокислоты – 1,5-дифосфат-2 –карбокси- 3-кетопентит.

Присоединение СО₂ к енольной форме рибулезо-1,5-дифосфата произойдет в том случае, если второй атом углерода станет нуклеофильным, а это произойдет в том случае, если ОН – группа при третьем атоме углерода лишится протона, то есть если молекула станет енолат – анионом, который и вступает в реакцию β-карбоксилирования (А).

3) Распад кетокислоты (Б):

1,5-дифосфат-2 –карбокси- 3-кетопентит + Н₂О →2∙3ФГК.

РуБФ-карбоксилаза составляет около 50% всех растворимых белков в листьях. Имеет молекулярную массу около 5,5∙10⁵ и состоит из восьми больших (мол. масса 51000 – 58000) и восьми малых субъединиц (мол. масса 12000 – 18000), организованных в единую структуру (рис. 4.4). Большие субъединицы кодируются хлоропластной ДНК, малые – ядерной ДНК.

Рис. 4.4. Строение РуБФ-карбоксилазы

Восстановление. 3ФГК восстанавливается до 3-фосфоглицеринового альдегида (ФГА).

Первоначально происходит образование 1,3-дифосфоглицерата, реакция катализируется ферментом фосфоглицераткиназой:

3-фосфоглицерат + АТФ ↔ 1,3-дифосфоглицерат + АДФ.

Данная реакция идет с затратой АТФ. Между новым остатком фосфорной кислоты и карбоксильной группой образуется смешанный ангидрид. Поскольку свободная энергия гидролиза этого ангидрида примерно такая же, как у фосфатного ангидрида в молекуле АТФ, реакция фосфоглицераткиназы обратима. Однако днем на свету все время происходит фотофосфорилирование, расход АТФ восполняется и равновесие реакции смещено в сторону образования 1,3-дифосфоглицерата.

Восстановление 1,3-дифосфоглицерата до 3-фосфоглицеринового альдегида протекает с участием НАДФН + Н⁺, катализирует данную реакцию фермент глицеральдегидфосфатдегидрогеназа:

1,3-дифосфоглицерат + НАДФН ↔ 3-фосфоглицериновый альдегид + НАДФ + Р_н.

Затем фосфоглицериновый альдегид за счет триозофосфатизомеразы изомеризувется в диоксиацетонфосфат (ДОАФ):

фосфоглицериновый альдегид ↔ диоксиацетонфосфат.

Регенерация. В результате фиксации трех молекул СО₂ в цикле Кальвина образуются шесть молекул триозофосфата. Одна из них выходит из цикла и вступает в дальнейшие биосинтетические процессы. Остальные пять молекул триозофосфата необходимы для регенерации трех молекул рибулезо-1,5-дифосфата, которые вновь вступают в цикл:

фосфоглицериновый альдегид + диоксиацетонфосфат ↔ фруктозо-1,6-дифосфат

Реакция катализируется альдолазой.

Фруктозо-1,6-дифосфат – это первая гексоза, которая образуется при фотосинтезе. Фруктозо-1,6-дифосфат гидролизуется до фруктозо-6-фосфат в необратимой реакции, катализируемой фруктозо-1,6-дифосфатазой. Фермент активен в присутствии ионов магния:

фруктозо-1,6-дифосфат + Н₂О → фруктозо-6-фосфат + Н₃РО₄.

Два верхних атома фруктозо-6-фосфата под действием фермента транскетолазы переносятся на фосфоглицериновый альдегид. Продуктами этой обратимой реакции являются ксилулозо-5-фосфат и эритрозо-4-фосфат:

фруктозо-6-фосфат + фосфоглицериновый альдегид ↔ ксилулозо-5-фосфат + эритрозо-4-фосфат.

Кофактор транскетолазы – тиаминпирофосфат (ТПФ). Он выполняет в этой реакции роль посредника:

а) ТПФ-СН₃ + фруктозо-6-фосфата → эритрозо-4-фосфат +ТПФ-СН₂-СНОН-СН₂ОН

б) гликольальдегидтиаминпирофосфат переносит гликоль на фосфоглицериновый альдегид и образуется ксилулозо-5-фосфат:

ТПФ-СН₂-СНОН-СН₂ОН + фосфоглицериновый альдегид → ксилулозо-5-фосфат + ТПФ.

Далее фруктозо-1,6-дифосфатальдолаза катализирует конденсацию эритрозо-4-фосфата с диоксиацетонфосфатом с образованием седогептулозо-1,7-дифосфата:

эритрозо-4-фосфата + диоксиацетонфосфатом ↔ седогептулозо-1,7-дифосфат.

Седогептулозо-1,7-дифосфат дефосфорилируется, образуется седогептулозо-7-фосфат. Седогептулозо-1,7-дифосфатаза катализирует эту необратимую реакцию:

седогептулозо-1,7-дифосфат + Н₂О → седогептулозо-7-фосфат + Н₃РО₄.

Углеводный остаток с двумя атомами углерода передается транскетолазой с седогептулозо-7-фосфата на 3-фосфоглицериновый альдегид. Образуются рибозо-5-фосфат и ксилулозо-5-фосфат:

седогептулозо-7-фосфат + 3-фосфоглицериновый альдегид ↔ рибозо-5-фосфат + ксилулозо-5-фосфат.

Три образовавшихся пентозофосфата преобразуются в рибулозо-5-фосфат. Ксилулозо-5-фосфат подвергается эпимеризации. Реакция катализируется рибулозофосфатэпимеразой:

ксилулозо-5-фосфат ↔ рибулозо-5-фосфат.

Рибозо-5-фосфат изомеризуется до рибулозо-5-фосфат. Реакцию катализирует фермент рибозофосфатизомераза:

рибозо-5-фосфат ↔ рибулозо-5-фосфат.

Три молекулы рибулозо-5-фосфата превращаются в рибулозо-1,5-дифосфат, катализируется эта реакция рибулозофосфаткиназой. Реакция идет с затратой АТФ. Эта реакция необратима, потому что фосфат переносится из макроэргической ангидридной связи в молекуле АТФ в эфирную связь с низкой свободной энергией гидролиза:

рибулозо-5-фосфат + АТФ → рибулозо-1,5-дифосфат +АДФ.

Фотосинтетический цикл замыкается.

В цикле есть четыре необратимые реакции:

- карбоксилирование,

- гидролиз фруктозодифосфата,

- гидролиз седогептулозодифосфата,

- фосфорилирование рибулозо-5-фосфата.

Пять ферментов цикла Кальвина активируются светом: рибулезодифосфаткарбоксилаза, триозофосфатдегидрогеназа, фруктозодифосфатаза, седогептулозодифосфатаза, фосфорибулозокиназа.

Фиксация одной молекулы СО₂ требует двух молекул НАДФН и трех АТФ.

Для синтеза одной молекулы глюкозы в цикле Кальвина необходимо 12 молекул НАДФН и 18 молекул АТФ.

Основные характеристики карбоксилирования. Главный механизм карбоксилирования при фотосинтезе обязан отвечать следующим требованиям:

Должен обеспечивать регенерацию акцептора СО₂.
Должен функционировать автокаталитически в качестве производительной реакции, в ходе которой субстрата образуется больше, чем используется.
Равновесие реакции карбоксилирования должно быть энергетически очень выгодным, чтобы компенсировать низкую концентрацию СО₂ в окружающей среде.
Катализирующая реакцию карбоксилаза должна обладать высоким сродством к СО₂, чтобы ее функционирование при низкой концентрации СО₂ было эффективным.

Этим требованиям удовлетворяет только восстановительный пентозофосфатный цикл.
Лекция 5

Фотодыхание

План.

Понятие фотодыхания.
История открытия цикла.
Химизм фотодыхания.
Особенности гликолатного цикла.
Регуляция фотодыхания.
Физиологическая роль фотодыхания.

Понятие фотодыхания. Фотодыхание – это поглощение растениями кислорода и выделение углекислого газа на свету. У С₃-растений его интенсивность может составлять до 50 % от интенсивности фотосинтеза. У С₄-растений фотодыхание практически отсутствует. Начальный этап фотодыхания связан с оксигеназной активностью фермента РуБФ-карбоксилаза и осуществляется в хлоропластах, последующие реакции проходят в пероксисомах и митохондриях. Фотодыхание имеет ряд отличий от «темнового» дыхания клеток, связанного с процессами окисления органических соединений в ходе цикла Кребса и работы электронтранспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий:

- фотодыхание активируется светом высокой интенсивности, тогда как процессы «темнового» дыхания митохондрий на свету ингибируются;

- фотодыхание усиливается в присутствии высоких концентраций кислорода, что связано с активацией в этих условиях оксигеназной функции фермента РуБФ-карбоксилазы; максимум «темнового» дыхания наблюдается при концентрации кислорода около 2 %;

- фотодыхание требует совместного функционирования хлоропластов, пероксисом и митохондрий; «темновое» дыхание связано исключительно с митохондриями;

- первичным продуктом фотодыхания являются двууглеродные органические кислоты – фосфогликолат, гликолат, глиоксилат, преобразование их приводит к образованию аминокислот – глицина и серина. Метаболизм фотодыхания представлен на рис.5.1.

Рис. 5.1. Метаболизм фотодыхания

История открытия цикла. Еще в 1779 году Я. Ингенгауз, проверявший результаты опытов Д. Пристли, который доказал, что на свету зеленые растения улучшают воздух, испорченный горением, обнаружил, что иногда днем, при очень большой освещенности и температуре, растения выделяют СО₂ и поглощают О₂. Я. Ингенгауз решил забыть об этих странных для него результатах и объявил, что Д. Пристли был прав. Это явление доказывало и большинство из его собственных 500 опытов.

В 1920 году О. Варбург заметил, что интенсивность фотосинтеза водорослей резко возрастает, если снизить концентрацию кислорода во внешней среде. Это означает, что одновременно с фотосинтезом происходят какие-то окислительные реакции, сопровождающиеся выделением углекислого газа и снижающие эффективность фотосинтеза.

Вспомнили об этом феномене только через полтора века и назвали его по типу газообмена, активирующегося на свету в зеленых клетках, фотодыханием.

О.В. Заленский пришел к выводу, что выделение углекислого газа листьями на свету необходимо рассматривать, «как самостоятельный физиологический процесс, связанный, но не идентичный происходящим в листе процессам фотосинтеза и дыхания»

Когда в 60 годы 20 века начали изучать фотодыхание, то оказалось, что большую роль в этом процессе играет рибулезодифосфат-карбоксилаза. Если мало СО₂ и много О₂, то она может присоединять к рибулезо-1,5-дифосфату не углекислый газ, а кислород, то есть этот фермент выполняет не только карбоксилирующую, но и оксигенирующую функцию. Кислород и углекислый газ ведут себя как субстраты, конкурирующие друг с другом за взаимодействие с РуБФ-карбоксилазой/оксигеназой (РуБФК/О), то есть кислород ингибирует карбоксилазную, углекислый газ – оксигеназную функцию этого фермента. Данный фермент может функционировать не только как карбоксилаза, но и как оксигеназа и катализировать окислительное расщепление рибулезо-1,5-дифосфата до фосфоглицириновой кислоты и фосфогликолевой кислоты.

Впервые процесс фотодыхания был описан в 1948 году П.А. Колесниковым, а затем в 1949 году – Клаггетом с сотрудниками.

Химизм фотодыхания. Упрощенная схема гликолатного пути представлена на рис.5.2.

Рис.5.2. Упрощенная схема гликолатного пути

Ключевой реакцией фотодыхания является окисление рибулезо-1,5-дифосфат при участии кислорода. Присоединение кислорода к молекуле рибулезо-1,5-дифосфату приводит к тому, что вместо двух молекул фосфоглицериновой (ФГК) кислоты образуется одна молекула ФГК и одна молекула фосфогликолата:

2 рибулезо-1,5-дифосфат + 2 О₂ → 2 ФГК + 2 фосфогликолат.

Реакция осуществляется благодаря оксигеназной активности фермента РуБФ-карбоксилазы.

Рециклирование фосфогликолата начинается с отщепления фосфорного остатка, которое катализирует фосфогликолатфосфатаза, локализованная в строме хлоропластов. Продукт этой реакции – гликолат. Гликолат покидает хлоропласт и поступает в специальную органеллу – пероксисому:

2 фосфогликолат – 2 Р_н → 2 гликолат.

Гликолат выносится из хлоропластов с помощью специфического транспортера и поступает в пероксисомы через неспецифические поры в их мембранах, которые образованы порином.

В пероксисоме гликолат реагирует с поглощаемым клеткой кислородом; в результате образуются глиоксилат и перекись водорода. Реакцию катализирует гликолатоксидаза. Гликолатоксидаза содержит кофактор флавинмононуклеотид (ФМН), который функционирует как редокс-посредник между гликолатом и кислородом:

2 гликолат + 2 О₂ → 2 глиоксилат + 2 Н₂О₂.

Перекись разлагается каталазой, которая находится в пероксисомах, на воду и кислород, который выделяется в атмосферу:

2 Н₂О₂ → 2 Н₂О + О₂.

Суммарно для окисления одного моля гликолата до глиоксилата потребляется 0,5 моля кислорода.

В пероксисоме происходит реакция аминирования глиоксилата. Фермент глиоксилатглицинаминотрансфераза осуществляет реакцию переноса аминогруппы с аминокислоты на глиоксилат. Глиоксилат в реакции трансаминирования, идущей при участии глиоксилатглицинаминотрансферазы, превращается в глицин, который транспортируется в митохондрию. 2 глиоксилат + 2 глутаминовая кислота → 2 глицин + 2 NH₃ + 2 α-кетоглутаровая кислота.

Превращение глиоксилата в глицин происходит в двух реакциях. Фермент глутамат-глиоксилатаминотрансфераза катализирует перенос аминогруппы от донора (глутамата) на акцептор глиоксилат. В другой реакции фермент серин-глиоксилатаминотрансфераза катализирует переаминирование глиоксилата серином. Эти два фермента, как и другие аминотрасферазы, содержит связанный пиридоксальфосфат с активной альдегидной группировкой:

2 глиоксилат + 2 глутаминовая кислота → 2 глицин + 2 NH₃ + 2 α-кетоглутаровая кислота.

2 глиоксилат + 2 серин → 2 глицин + 2 NH₃ + 2 гидроксипируват.

Глицин выходит из пероксисом через поры и транспортируется в митохондрии. Механизм транспорта до конца не изучен. Полагают, что он происходит с участием специфического переносчика.

Здесь из двух молекул глицина синтезируется одна молекула серина, образуется углекислый газ, аммиак. При этом происходит восстановление НАД. Реакция идет в две стадии и катализируется глициндекарбоксилазо- серингидроксиметилтрансферазным комплексом:

2 глицин → серин + СО₂ + NH₃ + НАДН + Н⁺.

Этот мультиферментный комплекс состоит из четырех различных субъединиц. Глициндекарбоксилазный комплекс митохондрий может составлять до 30 % - 50 % всех растворимых белков митохондрий в зеленых тканях. В митохондриях нефотосинтезирующих клеток растений белки окисления глицина присутствуют лишь в очень небольших количествах или вовсе отсутствуют.

СО₂ или выделяется в атмосферу, то есть теряется для растения, или используется в С₃-цикле. Предполагают, что НАДН может включиться в электронтранспортную цепь дыхания или экспортироваться из митохондрий за счет челночных механизмов в другие клеточные компартменты.

Серин транспортируется из митохондрии с участием специфического переносчика в пероксисому, где после дезаминирования превращается в оксипируват:

серин → оксипируват + NH₃.

Реакция катализируется серин-глиоксилат-аминотрансферазой.

Оксипируват затем восстанавливается при участии глиоксилатредуктазы в глицерат за счет НАДН:

оксипируват + НАДН → глицерат + НАД.

Глицерат транспортируется в хлоропласт. Вход глицерата в хлоропласты осуществляется с участием того же переносчика, который обеспечивает выход из хлоропластов гликолата. Этот переносчик осуществляет обмен гликолата на глицерат, а также котранспорт гликолата с протоном. Таким образом, этот переносчик делает возможным экспорт двух молекул гликолата в обмен на импорт одной молекулы глицерата.

Глицерат в хлоропластах фосфорилируется за счет АТФ в присутствии глицераткиназы, и образуется ФГК:

глицерат + АТФ → фосфоглицерат + АДФ.

ФГК – это конечный продукт цикла.

ФГК может поступать в С₃-цикл для регенерации рибулезо-1,5-дифосфата или использоваться для синтеза сахарозы и крахмала.

Таким образом, в ходе фотодыхания происходят реакции, связанные с поглощением кислорода (в хлоропластах и пероксисомах) и выделением углекислого газа (в митохондриях) (рис. 5.3.).

Рис.5.3. Возможный челночный перенос метаболитов между пероксисомами, митохондриями и хлоропластами в ходе гликолатного цикла

Особенности гликолатного цикла. Особенности гликолатного цикла:

- СО₂ образеется во время превращения двух молекул глицина в серин;

- О₂ расходуется для синтеза гликолата и глиоксилата;

- поглощается кислород и выделяется углекислый газ на свету в процессе метаболизма гликолата;

- образуется свободный аммиак, который используется для аминирования оксиглутарата, в результате чего образуется глутамат;

- гликолатный путь является глюконеогенетическим. ФГК – это продукт, который может использоваться для синтеза сахарозы и крахмала.

При фиксации СО₂ для превращения углекислого газа в триозофосфат требуется три молекулы АТФ и две молекулы НАДФН, оксигеназная реакция требует пяти молекул АТФ и трех молекул НАДН в расчете на одну молекулу кислорода.

В таблице отражен дополнительный расход АТФ и НАД(Ф)Н при разных соотношениях карбоксилазной и оксигеназной реакций.

Таблица 5.1– Дополнительные затраты на оксигеназную реакцию с участием рибулезо-1,5-дифосфата в отношении к затратам на фиксацию углекислого газа

Отношение карбоксилирование/оксигенирование	Дополнительные затраты
Отношение карбоксилирование/оксигенирование	АТФ	НАД(Ф)Н
2	83 %	75 %
4	42 %	38 %

В листе, где это соотношение составляет от двух до четырех карбоксилазных реакции на одну оксигеназную, дополнительный расход АТФ и НАД(Ф)Н для компенсации оксигеназной реакции составляет более чем 50 % от затрат на фиксацию СО₂.

Таким образом, побочная оксигеназная реакция рибулезо-1,5-дифосфаткарбоксилазы стоит растениям более чем трети перенесенных через тилакоидную мембрану протонов.

Реакции гликолатного цикла происходят в хлоропластах, пероксисомах и митохондриях. Следовательно, процесс фотодыхания требует совместной работы трех органелл клетки. В пероксисоме находятся главные ферменты этого цикла: гликолатоксидаза, каталаза и глиоксилатредуктаза. В митохондриях локализованы ферменты, с помощью которых происходит декарбоксилирование глицина с образованием серина и выделением углекислого газа. Цикл начинается и кончается в хлоропластах. В хлоропластах находятся РуБФ-карбоксилаза/оксигеназа и глицераткиназа. В клетке эти органеллы примыкают друг к другу. Они функционально зависят друг от друга.

С помощью гликолатного цикла азот переносится из пероксисомы в митохондрию. В течение гликолатного цикла происходит потеря СО₂, поглощенного в С₃-цикле. На десять оборотов цикла из десяти молекул рибулезо-1,5-дифосфата, образовавшихся в цикле Кальвина, одна молекула разрушается:

10 рибулезо-1,5-дифосфата + 10 О₂ → 10 фосфогликолат + 10 ФГК

10 ФГК → 5 ФГК + 5 СО₂;

10 ФГК + 5 ФГК → 15 ФГК → 9 рибулезо-1,5-дифосфата.

Регуляция фотодыхания. Фотодыхание связано с работой фермента РуБФ-карбоксилазы/оксигеназы, соотношение двух путей использования рибулезо-1,5-дифосфата будет зависеть от соотношения карбоксилазной и оксигеназной активности этого фермента. Следовательно, кинетические свойства фермента, температура и субстрату реакций – углекислый газ и кислород определяют направление ферментативной активности РуБФ-карбоксилазы и будут модулировать скорость фотодыхания. Повышение температуры, повышение интенсивности света и снижение парциального давления углекислого газа активирует фотодыхание.

Физиологическая роль фотодыхания. Гликолатный цикл выполняет важные функции в растительном организме:

является источником промежуточных веществ для различных синтезов;
играет важную роль в образовании аминокислот (серина и глицина), то есть связан с азотным обменом растений;
при образовании серина из глицина восстанавливается митохондриальный НАД, при окислении которого образуется АТФ;
избыток продуктов цикла Кальвина увеличивает скорость гликолатного цикла, а их недостаток усиливает интенсивность С₃-цикла.

Лекция 6

С₄-тип фотосинтеза

План.

История открытия С₄-пути фотосинтеза.

2. С₄-метаболизм у растений НАДФ-малатдегидрогеназного типа.

3. С₄-метаболизм у растений НАД-малатдегидрогеназного типа.

4. С₄-метаболизм у растений ФЭП-карбоксилазного типа.

5. Разнообразие С₄-метаболизма.

История открытия С₄-пути фотосинтеза. В течение ряда лет считалось, что первым акцептором углерода служит рибулозодифосфат и что первыми стабильными продуктами фотосинтеза являются трехуглеродные соединения. Представление это подверглось пересмотру после того, как выяснилось, что в опытах с ¹⁴СО₂ некоторые растения, например: кукуруза, сахарный тростник и родственные им тропические злаки ведут себя необычно: метка включается у них в четырехуглеродные органические кислоты: щавелевоуксусную кислоту (ЩУК), яблочную, аспарагиновую гораздо быстрее, чем в ФГК. Такие растения стали называть С₄-растениями.

История открытия С₄-пути фотосинтеза у некоторых высших растений ведет свое начало от исследований Корщака с сотрудниками. Они в конце пятидесятых годов заметили, что листья сахарного тростника после кратковременной инкубации в атмосфере с ¹⁴СО₂ на свету включают значительную часть радиоактивной метки в малат и аспартат. Сходные результаты были получены на кукурузе Ю. Карпиловым с сотрудниками в Казани. Данные советских исследователей стали известны более широкому кругу ученых в середине шестидесятых годов только после публикации работы Коршака. Наконец, группой Хэтча (1966 – 1969 гг) в Австралии данный эффект был обнаружен у многих других растений тропического происхождения. Они провели исследования по разбавлению импульсной метки у сахарного тростника; идентифицировали ряд ферментов С₄-пути; показали, что у кукурузы некоторые ферменты по - разному распределены между хлоропластами мезофилла и хлоропластами обкладки проводящих пучков; выявили несколько других видов растений, у которых характер включения метки был точно таким же, как у сахарного тростника.

По мнению Ю. Карпилова «Хэтч и Слэк первыми указали, что эти виды имеют углеродный метаболизм фотосинтеза, принципиально отличающийся от обычного, «Кальвиновского», и описали его как новый путь карбоксилирования».

Анатомически С₃- и С₄- растения отличаются друг от друга. У С₄- растений имеются клетки обкладки и клетки мезофилла. Подобное строение получило название кранц-анатомией (Kranz – венец, корона, рис.6.1).

Рис. 6.1. Характерная анатомия листа С₄-растения:

Хлоропласты в обеих этих клетках морфологически различны.
Таблица 6.1 – Особенности хлоропластов мезофилла и хлоропластов клеток обкладки у С₄- растений

Хлоропласты мезофилла

Хлоропласты клеток обкладки

Граны крупные.
Активность ФС-II высока и генерируется много АТФ, НАДФН и О₂.
РуБФ-карбоксилазы практически нет, активность ФЭП-карбоксилазы велика.

Крахмала нет.

Граны отсутствуют, либо их очень мало и они мелкие.

Активность ФС-II мала и генерируется мало НАДФН и О₂, некоторое количество АТФ поставляет ФС-II.

Концентрация РуБФ-карбоксилазы велика.
Крахмальные зерна в изобилии.

Обе эти группы клеток у С₄-растений кооперативно осуществляют превращение СО₂ в гексозу и последующее ее превращение в крахмал.

С₄-цикл можно разделить на две стадии: стадию карбоксилирования, происходящую в клетках мезофилла, и стадию декарбоксилирования, идущую в клетках обкладки. Первая из этих реакций протекает в клетках мезофилла. Здесь локализованы ферменты: пируват, ортофосфат – дикиназа, ФЭП-карбоксилаза, НАДН-малатдегидрогеназа. Они участвуют в карбоксилирующей стадии С₄-пути:

Пируват + Р_н + АТФ → ФЭП + АМФ + РР_н (пируват, ортофосфат – дикиназа)

ФЭП + СО₂ → ЩУК + Р_н (ФЭП-карбоксилаза)

ЩУК + НАДФН → малат + НАДФ (НАДН-малатдегидрогеназа).

Стадия декарбоксилирования протекает в клетках обкладки. Малат диффундирует через плазмодесмы в клетки обкладки, где происходит высвобождение СО₂ и его ассимиляция с участием рибулезо-1,5-дифосфаткарбоксилазы. У большинства С₄-растений декарбоксилирование малата катализируется ферментом малик – энзимом (декарбоксилирующей малатдегидрогеназой):

Малат – СО₂ - НАД(Ф) → пируват + НАД(Ф)Н.

На рис.6.2 показана упрощенная схема С₄-метаболизма.

Рис.6.2. Упрощенная схема С₄-метаболизма.

В настоящее время С₄–растения подразделяются на три основные подгруппы в соответствии с механизмом первичного декарбоксилирования. Соотношение метаболических путей, ведущих к образованию малата или аспартата, варьирует.

С₄-путь фотосинтеза чаще всего имеет место у растений засушливых и тропических районов.

С₄-метаболизм у растений НАДФ-малатдегидрогеназного типа. В эту группу растений входят такие культуры, как кукуруза, сахарный тростник, сорго, росичка кровяная, сыть округлая, ежовник, щетинник, бородач.

На рис. 6.3 Показана последовательность реакций и их компартментация.

Рис. 6.3. Механизм концентрирования СО₂ в растениях НАДФ-малатдегидрогеназного типа:Т – переносчик

В превращении пирувата и СО₂ в малат (пируват + СО₂ → малат) участвуют пять ферментов:

пируват + Р_н + АТФ → ФЭП + АМФ + РР_н (пируват, ортофосфат-дикиназа). В данной реакции один фосфатный остаток передается с АТФ на неорганический фосфат, это приводит к образованию пирофосфата. Второй остаток передается на гистидиновый остаток каталитического центра фермента (E – His). В качестве промежуточного продукта образуется фосфорный амид, фосфорный остаток передается на пируват, что приводит к образованию ФЭП. Механизм реакции:

Е –His + ATФ + Р_н ↔ E – His – Р_н + АМФ + РР_н

E – His – Р_н + пируват ↔ Е –His + ФЭП.

РР_н → 2 Р_н (пирофосфатаза)
АМФ + АТФ → 2 АДФ (аденилаткиназа)
ФЭП + СО₂ → ЩУК + Р_н (ФЭП-карбоксилаза)
ЩУК + НАДФН → малат + НАДФ (НАДФ-малатдегидрогеназа)

--------------------------------------------------------------------------------------------

В итоге: пируват + СО₂ + 2 АТФ + НАДФН → малат + НАДФ + 2 АДФ + 2 Р_н

ЩУК, образующийся в результате карбоксилирования ФЭП, с помощью специфического переносчика транспортируется в хлоропласты, где восстанавливается НАДФ-малатдегидрогеназой до малата. Образовавшийся малат диффундирует из клеток мезофилла в клетки обкладки через плазмодесмы. Для фиксации одной молекулы СО₂ требуется две молекулы АТФ и одна молекула НАДФН.

Диффузионный ток малата между двумя клетками требует наличия диффузионного градиента величиной примерно в 2 ∙ 10^-3 М. Малик-энзим, который локализован в хлоропластах клеток обкладки, катализирует превращение малата в пируват с выделением СО₂:

Малат + НАДФ → пируват + СО₂ + НАДФН (НАДФ-малатдегидрогеназа декарбоксилирующая).

Этот механизм связывает декарбоксилирование малата с восстановительным пентозофосфатным циклом (ВПФ – цикл).

Образовавшийся пируват с участием специфического переносчика экспортируется из хлоропластов клеток обкладки через плазмодесмы в клетки мезофилла, где он с помощью другого переносчика входит в хлоропласты клеток мезофилла. Здесь пируват вновь превращается в ФЭП.

С₄-метаболизм у растений НАД-малатдегидрогеназного типа. В эту группу растений входят такие культуры, как щирица колосистая, портулат огородный, просо южное, свинорой, амарант, иван-чай.

На рис. 6.4 показана последовательность реакций и их компартментация.

Рис. 6.4. Механизм концентрирования СО₂ в растениях НАД-малатдегидрогеназного типа, где Glu – глутамат, α- KG – α – кетоглутарат, Т – переносчик

В превращении аланина и СО₂ в аспартат (аланин + СО₂ → аспартат) участвуют шесть ферментов:

аланин + α – кетоглутарат → пируват + глутамат (аланинаминотрансфераза)
пируват + Р_н + АТФ → ФЭП + АМФ + РР_н (пируват, ортофосфат -дикиназа)
пирофосфаат → 2 Р_н (пирофосфатаза)
АМФ + АТФ → 2 АДФ (аденилаткиназа)
ФЭП + СО₂ → ЩУК + Р_н (ФЭП-карбоксилаза)
ЩУК + глутамат → аспартат + α – кетоглутарат (аспартатаминотрансфераза)

В итоге: аланин + СО₂ + 2 АТФ → аспартат + 2 АДФ + 2 Р_н
Для превращения аланина и СО₂ в аспартат необходимо затратить две молекулы АТФ.

Концентрация ЩУК в клетке меньше, чем 10^-3 М, поэтому ЩУК не может образовывать достаточно большой диффузионный градиент, чтобы обеспечить интенсивный ток соединения в клетки. В то же время концентрация глутамата в клетке велика, и в результате переаминирования ЩУК концентрация аспартата достигает 5∙ 10^-3 М. В связи с этим аспартат удобен для поддержания диффузионного тока между клетками мезофилла и обкладки.

После диффузии в клетки обкладки аспартат специфическим переносчиком транспортируется в митохонлрии, где аспартат превращается в ЩУК:

Аспартат + α-кетоглутарат → ЩУК + глутамат (аспартатаминотрансфераза).

Затем ЩУК восстанавливается до малата:

ЩУК + НАДН → малат + НАД (НАД-малатдегидрогеназа).

Малат декарбоксилируется с образованием пирувата а НАД, образовавшийся в реакции восстановления ЩУК, вновь восстанавливается до НАДН:

Малат + НАД → пируват + СО₂ + НАДН (НАД-малик-энзим)

Образовавшийся СО₂ диффундирует в хлоропласты, где включается в цикл Кальвина. Пируват выходит из митохондрий через специфический переносчик в цитозоль, где превращается в аланин:

Пируват + глутамат → аланин + α-кетоглутарат (аланинаминотрансфераза).

Так как эта реакция равновесная, концентрация аланина выше, чем пирувата, то возникает диффузионный ток аланина в клетки мезофилла. Здесь аланин превращается в пируват, реакция катализируется ферментом аминотрансферазой. Пируват транспортируется в хлоропласты, где превращается в ФЭП под действием фермента пируватфосфатдикиназы.

Все молекулы НАДН, синтезируемые в митохондриях, используются для восстановления ЩУК. Для образования АТФ в результате окислительного фосфорилирования некоторые молекулы ЩУК, образованные в клетках мезофилла, восстанавливаются в хлоропластах клеток мезофилла до малата. Образовавшийся малат диффундирует в клетки обкладки, входит в митохондрии, где окисляется с помощью малик – энзима с образованием НАДН, который окисляется затем в дыхательной цепи с образованием АТФ.

С₄-метаболизм у растений ФЭП-карбоксилазного типа. В эту группу растений входят такие культуры, как баклажаны, просо крупное, хлорис.

На рис. 6.5 показана последовательность реакций и их компартментация.

Для превращения 3-ФГК и СО₂ в малат и Р_н требуются четыре фермента:

3-ФГК → 2-ФГК (фосфоглицеромутаза)

2-ФГК → ФЭП (енолаза)

ФЭП + СО₂ → ЩУК + Р_н (ФЭП-карбоксилаза)

ЩУК +НАДФН → малат + НАДФ (НАДФ-малатдегидрогеназа)

В итоге: 3-ФГК + СО₂ + НАДФН → малат + НАДФ + Р_н

Это превращение не требует АТФ, но для фиксации одной молекулы СО₂ необходима одна молекула НАДФН.

Рис. 6.5. Механизм концентрирования СО₂ в растениях ФЭП-карбоксилазного типа

ЩУК превращается в аспартат в клетках мезофилла, аспартат диффундирует в клетки обкладки, где с участием аминотрансферазы, локализованной в цитозоле, происходит регенерация оксалоацетата, в цитозоле под действием ФЭП-карбоксилазы ЩУК превращается в ФЭП и СО₂ с затратой АТФ. СО₂ диффундирует в хлоропласты, а ФЭП – обратно в клетки мезофилла. Некоторая часть малата, образованная в клетках мезофилла, диффундирует в клетки обкладки, там окисляется митохондриальным НАД-маликэнзимом. Образовавшийся НАДН является субстратом для образования АТФ в процессе митохондриального окислительного фосфорилирования. СО₂ поступает в цикл Кальвина.

В метаболизме С₄- ФЭП-карбоксилазного типа небольшая часть СО₂ высвобождается в митохондриях, а большая – в цитозоле.

Разнообразие С₄-метаболизма. У некоторых растений фиксация СО₂ ФЭП-карбоксилазой и окончательная фиксация СО₂ РуБФ-карбоксилазой может осуществляться иначе. Для некоторых видов Chenopodiaceae показано, что у данных видов С₄-метаболизм происходит в удлиненных клетках однотипного строения, в которых цитоплазма на периферическом конце обогащена ФЭП-карбоксилазой, а на другом конце находятся хлоропласты, содержащие РуБФ-карбоксилазу.

Лекция 7

Метаболизм по типу толстянковых.

План.

Общие представления о САМ-метаболизме.
Фиксация СО₂ .
Реакции, происходящие на свету.
Энергетические затраты при САМ метаболизме.
Особенности САМ-растений.

Общие представления о САМ-метаболизме. Суккуленты, произрастающие в засушливых областях, фиксируют атмосферный СО₂ с образованием четырехуглеродных соединений. Однако эти растения по своему физиологическому поведению отличается от С₄-растений. Устьица у них открыты ночью и закрыты днем. Такой тип поведения устьиц представляет несомненную выгоду для растений пустыни. Эти растения поглощают в ночное время атмосферный СО₂, образуя четырехуглеродные органические кислоты, главным образом яблочную кислоту. Роль первичного акцептора играет ФЭП, как и у С₄-растений. Днем, когда хлорофилл активируется светом, яблочная кислота декарбоксилируется с образованием трехуглеродного соединения и СО₂, которая используется в цикле Кальвина для построения шестиуглеродных соединений. Из трехуглеродных соединений регенерируется ФЭП, которая вновь может выступать в роли акцептора СО₂. У САМ-растений первичное карбоксилирование и образование шестиуглеродных сахаров протекают в одних и тех же клетках, но в разное время суток, а у С₄-растений процессы происходят одновременно. Принципиальная схема САМ-метаболизма представлена на рис. 7.1

Рис. 7.1. Схема САМ-метаболизма

Фиксация СО₂ . Фиксация СО₂ у САМ-растений происходит ночью в реакции с ФЭП, катализируемой ферментом ФЭП-карбоксилазой:

ФЭП + СО₂ + Н₂О → ЩУК + Р_н (реакция 1)

У многих САМ-растений ФЭП образуется при гликолитическом распаде крахмала, у других растений источником углерода могут служить растворимые углеводы такие, как сахароза и фруктаны. Крахмал, локализованный в хлоропластах, деградирует до триозофосфата, который экспортируется с помощью триозофосфат – фосфатного переносчика в цитозоль и там превращается в ФЭП (реакция 1).

ЩУК, образовавщийся в результате фиксации СО₂, восстанавливается до малата в цитозоле:

ЩУК + НАДН → малат + НАД (реакция 2)

Реакция 2 катализируется НАД-малатдегидрогеназой (рис. 7.2).

Рис. 7.2. САМ-метаболизм ночью

НАДН, используемый в этой реакции, образуется за счет окисления триозофосфата в цитозоле. Малат с затратами энергии поступает в вакуоль. Малат благодаря градиенту протонов переносится в вакуоль через малатный канал и в течение ночи хранится там. Происходит закисление. К утру рН вакуолярного сока может снижаться до 3. АТФ, необходимая для САМ-метаболизма, генерируется в процессе окислительного фосфорилирования в митохондриях при окисления малата.

Реакции, происходящие на свету. Малат днем через малатный канал транспортируется в цитоплазму, а затем - в хлоропласт. Затем малат декарбоксилируется. В зависимости от вида растения СО₂ может высвобождаться различными путями (с помощью НАДФ-маликэнзима, НАД-маликэнзима или ФЭП-карбоксикиназы):

НАДФ-маликэнзим:

малат + НАДФ → пируват + НАДФН + СО₂;

НАД-маликэнзим:

малат + НАД → пируват + НАДН + СО₂;

НАД-маликэнзим и ФЭП-карбоксикиназа:

малат + НАД → ЩУК + НАДН,

ЩУК + АТФ → ФЭП + АДФ + СО₂.

САМ-метаболизм НАДФ-маликэнзимного типа представлен на рис. 7.3.

СО₂ поступает в цикл Кальвина. Пируват с помощью пируватфосфатдикиназы превращается в ФЭП:

Пируват + АТФ + Р_н → ФЭП + АМФ + РР_н.

Образовавшийся ФЭП экспортируется в цитоплазму, а затем превращается 3-фосфоглицерат (рис.7.3). После входа в хлоропласты 3-фосфоглицерат в триозофосфат, который поступает в цикл Кальвина. Триозофосфаты используются для ресинтеза крахмала. Транспорт ФЭП, 3-фосфоглицерата, триозофосфата и фосфата осуществляется с участием триозофосфат – фосфатного переносчика.

Рис. 7.3. САМ-метаболизм днем.

<< предыдущая страница следующая страница >>