1. Биолюминесцентная реакция обелина 1 Биолюминесцентная реакция обелина - umotnas.ru o_O
Главная
Поиск по ключевым словам:
страница 1
Похожие работы
1. Биолюминесцентная реакция обелина 1 Биолюминесцентная реакция обелина - страница №1/1

Оглавление


1.Биолюминесцентная реакция обелина 1

1.Биолюминесцентная реакция обелина


Термин «фотопротеин» был впервые предложен в 1966 году как удобное общее определение белков, биолюминесцентная реакция которых выходит за рамки классической концепции взаимодействия между компонентами биолюминесцентных реакций [1].

Ca2+-регулируемые биолюминесцентные реакции, катализируемые фотопротеинами, ответственны за свечение морских кишечнополостных. В настоящее время наиболее изученными фотопротеинами являются акворин и обелин, выделенные соответственно из медузы Aequorea victoriaи гидроидного полипа Obelia longissima.

Молекула фотопротеина представляет собой стабильный фермент-субстратный комплекс, состоящий из апопротеина – односубъединичного полипептида (~22 кДа) и «преактивированного» кислородом субстрата – 2-гидропероксицелентеразина, прочно, но нековалентно связанного с белком внутри гидрофобной полости [2]. При связывании ионов кальция фотопротеин подвергается конформационному изменению и происходит реакция внутримолекулярного окислительного декарбоксилирования связанного с белком субстрата. В результате образуются продукт реакции, целентерамид, в возбужденном состоянии и СО2. Переход целентерамида из возбужденного состояния в основное сопровождается излучением кванта видимого света [3]. Механизм биолюминесцентной реакции заключается в распаде промежуточного соединения диокситанона и формировании карбонильной группы, которая является общей для всех целентеразин-зависимых фотопротеинов и люциферин-люциферазных систем. [4]. Недавно проведенные исследования Kotaro Mori и др. говорят о том, что эмиттером в биолюминесценции обелина и акворина в синглетно-возбужденном состоянии является фенолят-анион целентерамида [5]. Продукт биолюминесцентной реакции – комплекс апопротеина с целентерамидом – принято называть разряженным фотопротеином который можно разъединить на белок и целентерамид гель-фильтрацией. Поскольку комплекс целентерамида с белком характеризуется голубой флуоресценцией, он был назван также «голубым флуоресцентным протеином» [6].


  1. Структура фотопротеинов

Все Ca2+-регулируемые фотопротеины, в той или иной степени исследованные к настоящему времени, являются односубъединичными белками с молекулярной массой  22 кДа, обнаруживают высокую степень сходства аминокислотных последовательностей (≈ 75%) и содержат три кальций-связывающих сайта“EF-hand”, характерного для семейства Ca2+-связывающих белков [7,8,9]. Предполагается, что эти белки имеют общее эволюционное происхождение [10]. В то же время, присутствие целентеразина во многих нелюминесцентных организмах указывает на то, что эта молекула, скорее всего, не синтезируется морскими люминесцентными кишечнополостными, а приобретается в процессе питания [11].

Недавно были определены кристаллические структуры фотопротеинов обелина при разрешении 1,7 Å [2] и акворина при 2,3 Å [12] и 1,6 Å [13]. Белковые молекулы акворина и обелина имеют одинаковую третичную структуру, представляющую собой компактную глобулу с радиусом приблизительно 25 Å.

Молекула представлена двумя доменами из четырех спиралей, обозначенных как A (16-29), В (39-54), С (58-74), D (85-105) на N-концевом домене, и Е (110-122), F (132-142), G (148-157), H (168-180) на С-концевом домене [14]. N- и С-концевые домены имеют чашеподобную структуру, внутренняя полость которой образована боковыми цепями гидрофобных аминокислот. В центре этой гидрофобной полости располагается защищенная от растворителя молекула 2-гидропероксицелентеразина.

Анализ структур акворина и обелина показал, что их молекулы состоят из четырех участков, представленных структурными мотивами типа спираль-поворот-спираль (СПС), являющиеся кальций-связывающими сайтами [15]. Петля из девяти аминокислотных остатков В-спирали формирует первый кальций-связывающий сайт СПС I (рисунок 3, I). C- и D-спирали соединяются петлей из десяти аминокислотных остатков. Аминокислотные остатки, формирующие эту петлю не способны координировать кальций и, следовательно, этот СПС II фрагмент не функционирует как кальций связывающий сайт. E- и F-спирали соединяются петлей из девяти аминокислотных остатков и, вместе с третьим остатком F-спирали, формируют СПС III мотив (второй кальций-связывающий сайт (рисунок 3, III)). G- и Н-спирали связаны петлей из десяти аминокислотных остатков, и вместе с третьим аминокислотным остатком Н-спирали формируют СПС IV мотив (третий кальций-связывающий сайт (рисунок 3, IV)). Две петли соседних СПС мотивов взаимодействуют через водородные связи в форме антипараллельных β-структур [16]. Электростатические потенциалы поверхностей трех Са2+-связывающих сайтов (СПС мотивы I, III и IV) отрицательны. Это также говорит о способности этих областей связывать ионы кальция.

Внутренняя полость фотопротеинов гидрофобна и образована боковыми цепями аминокислотных остатков, локализованных практически во всех -спиралях, формирующих молекулу белка.



h:\рисунки\2 celenteramide - копия.jpg

Водородные связи показаны пунктиром, расстояние указано в ангстремах, W1и W2–молекулы воды

Рисунок 1 – Схематическое изображение 2-гидропероксицелентеразина в молекуле обелина в окружении аминокислот, формирующих водородные связи с атомами субстрата

Имеется только четыре гидрофильных остатка (His22, Tyr138, His175 и Tyr190), боковые цепи которых направлены внутрь (рисунок 1). Практически все аминокислотные остатки, формирующие активный центр, являются консервативными. Еще до определения пространственной структуры была показана важность некоторых аминокислот для биолюминесценции фотопротеинов. Молекулы Trp92, Trp114, Trp135 и Trp179 находятся непосредственно в окружении молекулы 2-гидропероксицелентеразина [2]. Боковые цепи Trp92 и Trp179 образуют “сэндвич-структуру” с 6-(-n-гидрокси)-фенильным кольцом. Плоскости фенильного кольца и индольного кольца Trp92 почти параллельны. Триптофаны 114 и 135 размещаются вблизи 2-(-n-гидрокси)-бензильной группы субстрата и также формируют “сэндвич-структуру”. При этом четыре остатка триптофана как бы фиксируют молекулу 2-гидропероксицелентеразина во внутренней полости. Кроме того, атом О25 6-(-n-гидрокси)-фенильной группы и NH-группа индольного кольца Trp92 формируют водородную связь [9]. Также триптофановые остатки участвуют в резонансном переносе энергии на целентерамид, увеличивая выход его фотолюминесценции [17].

Значимость остатков гистидина для биолюминесценции фотопротеинов была продемонстрирована с помощью мутагенеза и химической модификации [18,19]. Молекулы His22 и His175 находятся в непосредственной близости от молекулы субстрата как в обелине, так и в акворине (рисунок 4) [12,2]. His175 формирует водородную связь с OH-группой Tyr190 и находиться на расстоянии 3,24 Å от атома О18 2-гидропероксицелентеразина, тогда как His22 образует водородную связь с гидроксилом 6-(-n-гидрокси)-фенильной группы. Два других гидрофильных остатка, Tyr138 и Tyr190, также формируют водородные связи с атомами 2-гидропероксицелентеразина – Tyr138 с N1-атомом, а Tyr190 с C2-гидроперокси-группой (рисунок 4). Связи, формируемые His175 и Tyr190, выполняют функцию «стабилизатора» такого нестабильного соединения, как 2-гидропероксицелентеразин [9].


  1. Хемилюминесцентная реакция целентеразина и флуоресцентные формы целентерамида

Целентеразин – это соединение, способное участвовать в хемилюминесцентных реакциях и широко распространенное в светящихся морских организмах. Хемилюминесцентная реакция целентеразина завершается испусканием кванта света (λmax = 465 нм) при проведении реакции в ацетонитриле, диметилформамиде (ДМФ) или диметилсульфооксиде (ДМСО) при добавлении незначительного количества щелочи в качестве катализатора (t-BuOK, NаOH, гидроксид тетраметиламмониума, триэтиламин) [20].


механизм целентеразина

Рисунок 2 - Механизм люминесцентной реакции целентеразина

Увеличение количества щелочи приводит к смещению флуоресценции в длинноволновую область (λmax = 530-550 нм). Целентерамид слабо флуоресцирует в водных растворах (λmax = 465 нм), но в органических растворах он флуоресцирует гораздо ярче и в более коротковолновой области (λmax = 400 нм). Изучая люминесценцию целентерамида, Хори и др. [21] предположили, что эмиттерами хемилюминесценции целентеразина могут быть амид анион целентерамида и дианион (фенолят анион + амид анион). Последний они предложили в качестве эмиттера желтой флуоресценции.

Изучение свечения целентерамида и его аналогов в четырех различных растворителях (ДМСО, ацетонитрил, бензол и н-бутанол) показало, что целентерамид может образовывать четыре различные флуоресцентные формы, таких как протонированная форма, амид анион, комплекс с частичным переносом протона, резонансная структура фенолят-пиразин-N(4) анион (рисунок 3) [20]. Недавно проведенные расчеты люминесценции и абсорбции различных форм целентерамида в водной и гидрофобной среде показали, что наиболее вероятно образование фенолят аниона, чем амид аниона путем депротонирования нейтральной формы в возбужденном состоянии. Депротонирование фенолят аниона для формирования дианиона целентерамида невозможно [22].



h:\flour forms.png

Рисунок 3 – Флуоресцентные формы целентерамида



Однако недавно проведенные квантово-химические расчеты показали, что в фотопротеине обелине в качестве эмиттера фотолюминесценции могут выступать протонированная форма целентерамида и комплекс с частичным переносом протона от фенольной группы целентерамида на протон акцепторное аминокислотное окружение – His22. При этом, позиция водородного атома фенольной группы целентерамида оказывает сильное влияние на длину волны испускания. Образование амид аниона и фенолят пиразин аниона в фотопротеине обелине невозможно [23, 24]. Также теоретические расчеты фотолюминесцентных спектров целентерамида в газовой фазе и в двух растворителях – бензоле и ацетонитриле показали, что люминесцентные свойства целентерамида зависят как от полярности растворителя, так и от ковалентного характера O-H связи фенольных групп целентерамида [25].


  1. Список использованных источников

1. Shimomura, O. Partial purification and properties of the Chaetopterus luminescence system / O. Shimomura, F.H. Johnson // Bioluminescence in Progress, eds. F.H. Johnson and Y. Haneda. – Princeton: Princeton University Press, 1966. – P. 495-521.

2. Liu, Z.J. Structure of the Ca2+- regulated photoprotein obelin at 1.7 Å resolution determined directly from its sulfur substructure / Z.J. Liu, E.S. Vysotski, C.J. Chen, J.P. Rose, J. Lee, B.C. Wang // J. Protein Science, 2000. - V. 9, N 11. - Р. 2085-2093.

3. Teranishi, K. Luminescence of imidazo[1,2-a]pyrazin-3(7H)-one compounds / K. Teranishi // J. Bioorganic Chemistry. – 2007. – V. 35. – P. 82 – 111.

Режим доступа: http://dx.doi.org/10.1016/j.bioorg.2006.08.003

4. Navizet, I. The Chemistry of Bioluminescence: An Analysis of Chemical Functionalities/ I. Navizet, Y.-J. Liu, N. Ferré, D. Roca-Sanjuán, R. Lindh// ChemPhysChem. – 2011. – V. 12. – P. 3064−3076.

Режим доступа: http://dx.doi.org/10.1002/cphc.201100504

5. Mori, K. Real light emitter in the bioluminescence of the calcium-activated photoproteins aequorin and obelin: light emission from the singlet-excited state of coelenteramide phenolate anion in a contact ion pair/ K. Mori, S. Maki, H. Niwa, H. Ikedab, T. Hirano// Tetrahedron. – 2006. – V. 62. – P. 6272–6288.

6. Shimomura, O. Calcium binding, quantum yield, and emitting molecule in aequorin bioluminescence / O. Shimomura, F.H. Johnson // Nature. – 1970. – V. 227. – P. 1356 – 1357.

7. Markova, S.V. Obelin from the bioluminescent marine hydroid Obelia geniculata: cloning, expression, and comparison of some properties with those of other Ca2+-regulated photoproteins / S.V. Markova, E.S. Vysotski, J.R. Blinks, L.P. Burakova, B.C. Wang, J. Lee // J. Biochemistry. - 2002. - № 41. – Р. 2227–2236.

8. Vysotski, E.S. Ca2+-regulated photoproteins: structural insight into the bioluminescence mechanism / E.S. Vysotski, J. Lee // Acc. Chem. Res. – 2004. - № 37. – P. 405–415.

9. Высоцкий, Е.С. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных / Е.С. Высоцкий, С.В. Маркова, Л.А. Франк // Журн. Молекулярная биология. – 2006. – Т 40, № 3. – С. 404 – 416.

10. Hastings, J.W. Bioluminescence / J.W. Hastings, T. Wilson // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. - 1998. – 14. – P. 197-230.

11. Haddok, S.H. Can coelenterates make coelenterazine? Dietary requirement for luciferin in cnidarian bioluminescence / S.H. Haddok, T.J. Rivers, B.H. Robison // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2001. – 98. – Р. 11148 – 11151.

12. Head, J.F. The crystal structure of the photoprotein aequorin at 2,3 Å resolution / J.F. Head, S. Inouye, K. Teranishi, O. Shimomura // J. Nature. –2000. – 405. – P. 372–376.

13. Toma, S. The crystal structures of semi-synthetic aequorin / S. Toma, K.T. Chong, A. Nakagawa, K. Teranishi, S. Inouye, O. Shimomura // J. Protein Sci. – 2005. – 14. – P. 409–416.

14. Stepanyuk, G.A. Interchange of aequorin and obelin bioluminescence color is determined by substitution of one active site residue of each photoprotein / G.A. Stepanyuk, S. Golz, S.V. Markova, L.A. Frank, J. Lee, E.S. Vysotski // FEBS Letters. – 2005. – 579. – P. 1008 - 1014.

15. Deng, L. All three Ca2+-bindung loops of photoproteins bind calcium ions: The crystal structures of calcium-loaded apo-aequorin and apo-obelin / L. Deng, E.S. Vysotski, S.V. Markova, Z.J. Liu, J. Lee, J. Rose, B.C. Wang // J. Protein Science. – 2005. – 14. – P. 663 – 675.

16. Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М.: Медицина. - 1982. – С. 62.

17 . Eremeeva, E.V. The intrinsic fluorescence of apo-obelin and apo-aequorin and use of its quenching to characterize coelenterazine binding/ E.V. Eremeeva, S.V. Markova, A.H. Westphal, A.J.W.G. Visser, W.J.H. van Berkel, E.S. Vysotski// FEBS Letters. – 2009. – V. 583. – P. 1939–1944.

18. Ohmiya, Y. Bioluminescence of the Ca2+-binding photoprotein, aequorin, after histidine modification / Y. Ohmiya, F.I. Tsuji // FEBS Lett. – 1993. – 320. – P. 267–270.

19. Bondar, V.S. In: Bioluminescence and Chemiluminescence: Perspectives for the 21st century / V.S. Bondar, L.A. Frank, N.P. Malikova, E.V. Inzhevatkin, V.A. Illarionova, E.S Vysotski // Eds Roda A., Pazzagli M., Kricka L.J., Stanley P.E. Chichester: John Wiley & Sons. – 1999. – P. 400–403.

20. Shimomura, O. Light-emitters involved in the luminescence of coelenterazine / O. Shimomura, K. Teranishi // J. Luminescence. - 2000. - № 15. - Р. 51-58.

21. Hori, K. Chemiluminescence of Renilla (sea pansy) luciferin and its analogues / K. Hori, J.E. Wampler, M.J. Cormier // J. Chem. Commun. - 1973. – P. 492-494.

22. Min, C.-g. The fluorescent properties of coelenteramide, a substrate of aequorin and obelin/ C.-g. Min, Z.-s. Li, A.-m. Rena, L.-y. Zoua, J.-f. Guoc, J.D. Goddardd// Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. – 2013. – № 251. – P. 182– 188.

Режим доступа: http://dx.doi.org/10.1016/j.jphotochem.2012.10.028

23. Томилин, Ф.Н. Флуоресценция кальций-разряженного обелина: структура и молекулярный механизм формирования эмиттера / Ф.Н. Томилин, Л.Ю. Антипина, Е.С. Высоцкий, С.Г. Овчинников, И.И. Гительзон // ДАН. – 2008. – Т. 422, № 3. – С. 1-6.

Режим доступа: http://dx.doi.org/10.1134/S0869565208270297

24. Ovchinnikov, S. Quantum Chemical Modeling in the Molecular Ecology/ S. Ovchinnikov, F. Tomilin, P. Artushenko, V. Sukhovol’sky, T. Ovchinnikova, P. Volkova, Y. Baranchikov, E. Vysotskii// Developments in Environmental Modelling. – 2012. – V. 25. – P. 3–13.

Режим доступа: http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-444-59396-2.00001-8

25. Chen, S.-F. Chemiluminescence of Coelenterazine and Fluorescence of Coelenteramide: A Systematic Theoretical Study/ S.-F. Chen, I. Navizet, D. Roca-Sanjuán, R. Lindh, Y.-J. Liu, N. Ferré// J. Chem. Theory Comput. – 2012. – №8. – P. 2796−2807.

Режим доступа: http://dx.doi.org/10.1021/ct300356j